农业农村部公告第323号-10-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号一10—2020 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆GTS40-3-2 及其 衍生品种定量PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products— Q uantitative PCR method for herbicide-tolerant soybean GTS40-3-2 and its derivates 2020-08-04 发 布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 农业农村部公告第323号—10—2020 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出， 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所、上海市农 业科学院、中国农业科学院生物技术研究所、上海交通大学、天津市农业科学院。 本标准主要起草人：温洪涛、梁晋刚、丁一佳、张旭冬、刘华、杨洋、李亮、关海涛、樊春海、兰青阔、张 瑞英。 工 1 农业农村部公告第323号— 10-2020 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆 GTS40-3-2 及其衍生品种定量 PCR 方法 1 范围 本标准规定了转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2 转化体特异性定量 PCR 检测方法。 本标准适用于转基因耐除草剂大豆 GTS40-3-2 及其衍生品种，以及制品中GTS40-3-2 转化体的定量 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部2031号公告— 19—2013 转基因植物及其产品成分检测 抽样 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 GTS40-3-2 转化体特异性序列 event-specific sequence of GTS40-3-2 GTS40-3-2 的外源插入片段5端与大豆基因组的连接区序列，包括大豆基因组序列及转化载体 T- DNA 部分序列。 4 原理 根据耐除草剂大豆 GTS40-3-2 转化体特异性序列和 Lectin 内标准基因特异性序列设计引物和 TaqMan 荧光探针，对标准样品和试样同时进行实时荧光定量 PCR 扩增。根据标准样品模板拷贝数与 Ct 值间的线性关系，分别绘制外源基因和内标准基因的标准曲线。计算试样中GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标准基因的拷贝数及其比值。 5 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 5.1 TaqMan 荧光定量 PCR 扩增试剂盒。 5.2 10 mol/L氢氧化钠(NaOH) 溶液：在160 mL 水中加入80.0 g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加 水定容至200 mL。 5.3 500 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?) 溶 液(pH 8.0):称取18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见5.2)直至EDTA-Na? 完全溶解，用氢氧化钠溶液(见5.2)调 pH 至8.0,加水定容至100mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌20 min。 5.4 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) 溶 液(pH8.0): 称取121. 1 g 三羟甲基氨基甲烷溶 解于800 mL 水中，用盐酸调 pH 至8 . 0,加水定容至1000 mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌 20 min。 5.5 TE 缓冲液(pH 8.0):分别量取10mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见5.4)和2 mL 乙二胺四乙酸 二钠溶液(见5.3),加水定容至1000mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌20 min。 2 农业农村部公告第323号—10—2020 5.6 引物和探针 5.6.1 Lectin 基因 Lectin-F:5-TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT-3; Lectin-R:5-CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC-3