农业农村部公告第323号-13-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号— 13—2020 转基因植物及其产品成分检测 crylA基因定性PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products— Qualitative PCR method for crylA gene 2020-08-04 发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I 农业农村部公告第323 13-2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、中国农业科学院生物技术研究所、上海交通大学、安徽 省农业科学院、天津市农业科学院、黑龙江省农业科学院。 本标准主要起草人：李亮、宋贵文、刘卫晓、李文龙、宛煜嵩、金芜军、秦瑞英、马卉、樊春海、兰青阔、温 洪涛、董美。 1 农业农村部公告第323号—13—2020 转基因植物及其产品成分检测 crylA 基因定性 PCR 方法 1 范围 本标准规定了转 crylA 基因植物中crylA 基因的定性 PCR 检测方法。 本标准适用于含 crylA 基因的转基因植物及其制品中crylA 基因成分的定性PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部2031号公告— 19—2013 转基因植物及其产品成分检测 抽样 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 cryIA 基因 crylA gene 来源于苏云金芽孢杆菌的 crylA 类杀虫蛋白基因，本标准是指 crylAb、crylAc、cry1A.105 和 crylAb/Ac 基因，存在于转化体玉米 Bt11、玉米 MON810、 玉米 C0030.3.5、玉米 MON89034、 玉 米 Bt176、玉米双抗12-5、玉米 Bt506、水稻科丰6号、水稻科丰8号、水稻 TT51-1、水稻克螟稻、棉花 MON531、 棉花 MON15985、 棉花 T304-40、大豆MON87701 和大豆 DAS-81419-2 中。 4 原理 针对上述crylA 序列设计了含有简并碱基的特异性引物，扩增相应的 crylA 基因序列。依据是否扩 增获得预期的DNA 片段，判断样品中是否含有 crylA 基因成分。 5 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 5.1 琼脂糖。 5.2 10g/L 溴化乙锭(EB) 溶液：称取1.0g 溴化乙锭，溶解于100mL 水中，避光保存。 警告——溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。 注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 5.3 10 mol/L氢氧化钠(NaOH) 溶液：在160 mL 水中加入80.0 g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加 水定容至200 mL。 5.4 500 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?) 溶液(pH 8.0):称取18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见5.3)直至 EDTA-Na? 完全溶解，用氢氧化钠溶液(见5.3)调 pH 至8.0,加水定容至100 mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.5 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI) 溶液(pH8.0): 称取121.1g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 800mL 水中，用盐酸调 pH 至8.0,加水定容至1000mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.6 TE 缓冲液(pH8.0): 分别量取10mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见5.5)和2 mL 乙二胺四乙酸 2 农业农村部公告第323号—13—2020 二钠溶液(见5.4),加水定容至1000mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.7 50×TAE 缓冲液：称取242.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500 m