农业农村部公告第323号-21-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号一21—2020 转基因植物及其产品成分检测 数字PCR 方法制定指南 Detection of genetically modified plants and derived products— Technical guidelines for development of digital PCR methods 2020-08-04 发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I 农业农村部公告第323号—21—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、天津市农业科学院。 本标准主要起草人：兰青阔、宋贵文、赵新、李夏莹、陈锐、沈晓玲、李葱葱、李亮、温洪涛、王永 1 农业农村部公告第323号—21-2020 转基因植物及其产品成分检测 数字 PCR 方法制定指南 1 范围 本标准规定了转基因植物及其产品数字PCR 检测方法的建立与确认的总体要求。 本标准适用于转基因植物及其产品成分检测的数字 PCR 检测方法的建立与确认。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适合于本文件。 农业部2259号公告—4—2015 定性 PCR 方法制定指南 农业部2259号公告—5—2015 实时荧光定量 PCR 方法制定指南 3 术语和定义 农业部2259号公告—4—2015和农业部2259 号公 2015界定的以及下列术语和定义适用于 本文件。 3.1 数字 PCR digital PCR 将原始PCR 反应体系进行分割，进而对所有小的反应体系进行扩增，通过阳性率和泊松分布计算获 得样品中靶序列拷贝数或拷贝数浓度。 注：现阶段数字 PCR 包括芯片式及微滴式两种。 3.2 微反应体系 tiny reaction partition 将 DNA 模板、引物/荧光探针、DNA 聚合酶及其缓冲液等 PCR 反应体系充分混匀后，通过乳化、芯 片等方式分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光 PCR 反 应体系。 3.3 正确度 trueness 多次测试的均值与采纳的标准值之间的接近程度。 4 实验室资质 进行转基因生物数字PCR 检测方法的建立与确认的实验室， 一般应满足以下要求： a) 具备资质认定和/或实验室认可的条件及证明； b) 从事过转基因植物成分定量测量的工作； c) 参加过权威部门组织的转基因植物定量测量能力验证或计量比对，并且测量结果在可控范围内。 5 技术要求 5.1 方法的建立 数字PCR 方法的建立应包括如下步骤： a) 检测引物和探针的设计与筛选：依据靶序列设计引物和探针，通过试验对其进行比较分析，筛选 出具有严格特异性和灵敏度的引物和探针组合； b) PCR 反应体系和反应程序优化：通过试验确定适合的反应体系(最适模板量、引物、探针浓度等) 2 农业农村部公告第323号—21-2020 及反应程序(退火温度、循环数等),能有效区分阳性信号和阴性信号；采用多重 PCR 检测方法 的，应提供与单重 PCR 检测方法的对比结果； c) 方法特异性测试：通过试验验证检测方法的特异性，特异性测试样品至少应包括3类： 1) 含有靶序列的转基因植物材料； 2) 不含有靶序列的转基因植物材料； 3) 不含靶序列的非转基因植物材料。 d) 线性动态范围测试：依据技术平台，选择合理的拷贝数浓度测试范围，确定方法的线性动态范围、 定量限。测试浓度点数一般不少于5个，至少3次重复，每次试验至少设置3个平行； e) 方法适用性测试：选择合适的加工品类型，测试方法的适用性。 5.2 实验室内方法验证 对建立的数字 PCR 方法，在实验室内进行确认时，应达到以下要求： a) 线性度：线性动态范围的线性度以线性回归曲线的决定系数R2 表示，均值一般应≥0.98; b) 精密度：线性动态范围内的精密度用重复性相对标准偏差RSD, 表示， 一般应≤25%; c) 正确度：在整个线性动态范围内，正确度偏差不超过标准值的25%; d) 定量限：线性动态范围内，符合精密度条件的最低拷贝数浓度； e) 再现性：由两个不同操作人员，在两个不同时间段，对包含不同质量分数的同批样品(至少包括阳 性样品