农业农村部公告第323号-14-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号— 14—2020 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米C0010.1.3 及其衍生品种 定性PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products— Qualitative PCR method for herbicide-tolerant maize C0010.1.3 and its derivates 2020-08-04发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I 农业农村部公告第323号—14—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、农业农村部环境保护科研监测所。 本标准主要起草人：修伟明、刘鹏程、杨殿林、章秋艳、沈晓玲、李刚、赵建宁、刘红梅、张贵龙。 农业农村部公告第323号— 14—2020 转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂玉米 C0010.1.3 及其衍生品种定性 PCR 方法 1 范围 本标准规定了转基因耐除草剂玉米 C0010.1.3 转化体特异性定性PCR 检测方法。 本标准适用于转基因耐除草剂玉米 C0010.1.3 及其衍生品种，以及制品中C0010.1.3 转化体成分的 定性PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部1861号公告— 3—2012 转基因植物及其产品成分检测 玉米内标准基因定性 PCR 方法 农业部2031号公告— 19—2013 转基因植物及其产品成分检测 抽样 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 农业部1861号公告— 3—2012界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 C0010.1.3 转化体特异性序列 event-specific sequence of C0010.1. 3 C0010.1.3 的外源插入片段5端与玉米基因组的连接区序列，包括玉米基因组序列与转化载体 T- DNA 部分序列。 4 原理 根据耐除草剂玉米C0010.1.3 转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR 扩增。依据是否 扩增获得预期的DNA 片段，判断样品中是否含有耐除草剂玉米 C0010.1.3 转化体成分。 5 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 5.1 琼脂糖。 5.2 10 g/L溴化乙锭(EB) 溶液：称取1.0g 溴化乙锭(EB), 溶解于100 mL 水中，避光保存。 警告——溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。 注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 5.3 10 mol/L氢氧化钠(NaOH) 溶液：在160mL 水中加入80.0g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加 水定容至200 mL。 5.4 500 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?) 溶液(pH8.0): 称取18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见5.3)直至EDTA-Na? 完全溶解，用氢氧化钠溶液(见5.3)调 pH 至8.0,加水定容至100 mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌20 min。 5.5 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) 溶 液(pH 8.0):称取121. 1g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 800mL 水中，用盐酸调pH 至8.0,加水定容至1000mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.6 TE 缓冲液(pH8.0): 分别量取10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见5.5)和2mL 乙二胺四乙酸 2 农业农村部公告第323号—14—2020 二钠溶液(见5.4)溶液，加水定容至1000 mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.7 50×TAE 缓冲液：称取242.2g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500 mL 水