农业农村部公告第323号-19-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号一19—2020 转基因植物及其产品成分检测 抗环斑病毒番木瓜YK16-0-1 及其衍生品种 定性PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products— Qualitative PCR method for ringspot virus resistant papaya YK16-0-1 and its derivates 2020-08-04 发布 2020-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 I 农业农村部公告第323号—19—2020 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、中国热带农业科学院热带生物技术研究所、大连市食品 检验所、华南农业大学。 本标准主要起草人：李美英、张秀杰、郭安平、刘彦泓、梁晋刚、戴学东、贺萍萍、章秋艳、刘岑杰、夏启 玉、夏元凤、杨小亮、赵辉、肖苏生、张雨良、姜大刚、潘志文。 农业农村部公告第323号— 19—2020 转基因植物及其产品成分检测 抗环斑病毒番木瓜 YK16-0-1 及其衍生品种定性PCR 方法 1 范围 本标准规定了转基因抗环斑病毒番木瓜 YK16-0-1 转化体特异性普通 PCR 和实时荧光 PCR 两种检 测方法。 本标准适用于转基因抗环斑病毒番木瓜 YK16-0-1 及其衍生品种，以及制品中 YK16-0-1 转化体成分 的定性 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部2031号公告— 19—2013 转基因植物及其产品成分检测 抽 样 农业农村部公告第323号— 1—2020 转基因植物及其产品成分检测 番木瓜内标准基因定性 PCR 方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 农业农村部公告第323号— 1—2020界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 YK16-0-1 转化体特异性序列 event-specific sequence of YK16-0-1 YK16-0-1 的外源插入片段5端与番木瓜基因组的连接区序列，包括番木瓜基因组序列及转化载体 T-DNA 部分序列。 4 原理 根据抗环斑病毒番木瓜 YK16-0-1 转化体特异性序列设计特异性引物及探针，对试样进行 PCR 扩 增。依据是否扩增获得预期的 DNA 片段或典型扩增曲线，判断样品中是否含有抗环斑病毒番木瓜 YK16-0-1 转化体成分。 5 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。 5.1 琼脂糖。 5.2 10 g/L溴化乙锭(EB) 溶液：称取1.0g 溴化乙锭，溶解于100 mL 水中，避光保存。 警 溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。 注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 5.3 10 mol/L氢氧化钠(NaOH) 溶液：在160 mL 水中加入80.0 g 氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加 水定容至200 mL。 5.4 500 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na?) 溶液(pH 8.0):称取18.6 g 乙二胺四乙酸二钠，加入 70mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(见5.3)直至EDTA-Na? 完全溶解，用氢氧化钠溶液(见5.3)调 pH 至8.0,加水定容至100mL。 在103.4 kPa(121℃) 条件下灭菌20 min。 5.5 1mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI) 溶液(pH8.0): 称取121. 1g 三羟甲基氨基甲烷溶解于 2 农业农村部公告第323号—19—2020 800mL 水中，用盐酸调pH 至8.0,加水定容至1000mL。 在103.4 kPa(121℃)条件下灭菌20 min。 5.6 TE 缓冲液(pH 8.0):分别量取10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见5.5)和2 mL 乙二胺四乙酸 二钠溶液(见5.4),加水定容至10