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植物组织培养技术 培养基的制备配制10倍或100倍的母液，储存于冰箱中，无机盐母液最好一个月内用完。把Ca2+, Mn2+, Ba2+, SO42- 和PO43- 错开，以免生成沉淀。Fe必须单独配制往往采用硫酸亚铁与Na2-EDTA通过加热形成稳定的螯合铁，稳定保存，避免Fe2+，Fe3+ 与其他母液混合易产生沉淀现象。IAA，NAA，2,4-D等需先用少量95%酒精或1mol/L NaOH加热助溶后，再加水定溶。CTK—KT,BAP等先溶于1mol/L的HCl中，再加水定溶；叶酸需用少量稀氨水溶解。 步骤1. 烧杯 + 一定量的水 + 各组分2. 加蔗糖3. 定容至1升4. 调节PH值：5.8 如用酸度计-----加琼脂前调 用试纸-----加琼脂后调5. 加琼脂6. 分装7. 封口8. 灭菌，分装，封口后尽快灭菌。～2，121℃，15～20 min IAA,维生素，抗生素，酶类：遇热不稳定，需过滤灭菌—过～ｍ的生物滤膜。 培养基存放： 灭菌后的培养基不要马上使用，预培养3天后，若没有被菌污染，才可使用。 IAA和椰乳见光分解 外植体大小：一般～1.0 cm为宜叶片 花瓣：5mm2 茎段： 茎尖分生组织带一两个叶原基 ～ 越幼嫩，年限越短的组织具有较高的形态发生能力，组培越易成功。 外植体的消毒取材自来水冲洗70％的酒精表面消毒20～60 s无菌水冲洗消毒剂处理无菌水充分清洗备用 表1 各种消毒剂的特点消毒剂浓度mol/l去除难易消毒时间min消毒效果是否毒害植物次氯酸钙9～10易5～30很好低毒次氯酸钠2易5～30很好无H2O210～12最易5～15好无氯化汞0.1～1较难2～10最好剧毒酒精70～75易0.2～2好有 升汞浸泡 超净工作台由鼓风机，过滤器，操作台，紫外光灯和照明灯管等部分组成。过滤＞ｍ颗粒。不带细菌，真菌的过滤后的纯净空气，以24～30 m／min 吹。在正式使用前，关上玻璃罩开紫外灯20min，然后将玻璃罩打开，吹风20min(主要是将臭氧排放出去)后，可使用。 用具的灭菌准备接种前，将镊子，解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，以保证完全无菌状态。浸泡——灼烧——放凉——使用（反复此过程） 愈伤组织的培养? 一般来说，从接种外植体到出现愈伤组织，需要经过2周时间。2周之内就可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭，不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长得更快。2周以后，由于培养基中的营养成分已接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。 愈伤组织的继代培养? 组织培养中，培养物（细胞，愈伤组织，器官，试管苗等）培养一段时间后，为了防止培养的细胞团老化，或培养基养分利用完而造成营养不良及代谢物过多积累毒物等的影响，要及时将其接种到新鲜培养基中，进行继代培养。 在严格的无菌条件下(接种箱内)将愈伤组织连同原来的外植体，一起移到新的培养基上。 继代培养 固体培养继代时间可以长些，2～4周继代一次。 继代培养使用的培养基及培养条件要因培养阶段的不同，而选择适宜该物种的培养基及培养条件。 试管苗的培养? 当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的培养。试管苗的培养分为生芽培养和生根培养。要想培育出一株完整的试管幼苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养。如果顺序颠倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。生芽大约需要4～6周的时间，而生根培养时，1周以后就可以见到幼根了。注意，试管苗应该进行见光培养。 祝同学们考试取得优异成绩 教学资料整理仅供参考，