甲基化特异性PCR原理与引物设计说明.docxVIP

MSP 原 理 其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组 DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用 3 对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA 琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。 引物设计原则 标准的 PCR 引物设计原则同样适用于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了标准 PCR 的一些参数外,“MethPrimer”应用 3′端算法计算自身退火温度、末端退火温度、碱基对互补率、GC 含量、解链温度(Tm),而且还提供了上游引物和下游引物的 Tm 区别,以及引物中最大允许的单核苷酸重复率。因为所有非甲基化的“C” 都被转换成“T”, 所以“MethPrimer”中默认的重复“T”为 8 个,而其他碱基重复数为 5 个。 DNA 的完全硫化是很重要的,因此应选择含尽可能多的非甲基化CpG 的“C”区域作为源序列,设计引物。对于 BSP,引物设计的原则[1]:①为了区别甲基化 DNA 和非甲基化 DNA,引物不应含有 CpG 位点;②引物扩增的产物应包含尽可能多的CpG 位点。 对于 MSP 需要设计 2 对引物,一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化的DNA;另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化的DNA。根据甲基化的 DNA 为模板的 PCR 扩增甲基化的 DNA;根据非甲基化的 DNA 为模板的 PCR 扩增非甲基化的 DNA。MSP 引物设计的原则:①为了最大限度的区分甲基化与非甲基化,引物的 3′端至少包含 1 个 CpG 位点,我们可以自己设定 CpG 的“C”距 3′末端的最远距离。“MethPrimer”中默认值为 3,即是在引物的最后 3 个碱基中,至少有 1 个是 CpG 的“C”。②引物序列中应包含尽可能多的CpG 位点。 ③甲基化引物和非甲基化引物序列 3′端应处于相同的 CpG 位点。如果,2 对引物不在相同的 CpG 位点退火, PCR 结果就不能准确反映样本 DNA 甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度,在起始位点和长度上也可以不同。一般非甲基化引物比甲基 化引物长,因为受 Tm 值限制,由于非甲基化引物中的“C”转化成“T”,导致 GC 含量降低,从而引起 Tm 降低。④2 套引物应有相近的 Tm 值,“MethPrimer”中默认 2 套引物 Tm 值相差不超过 5℃,这种限制可使 2 个 PCR 反应在同一 PCR 仪中进行。 问题解决参考 .dxy.cn/bbs/topic/9184927?keywords=MSP 引物设计步骤（以 CLEC14A 基因为例）： 找到目标基因的启动子区（promoter）序列首先打开 ensembl 页面：.ensembl.org/index.html 如图在搜索框第一个物种选择Human，基因填入要研究的基因名，点击Go 搜索结果页面第一条下面箭头所指处Regulation，点击它（这里面主要是基因调控区域的信息） 打开新的页面后，下拉至长长的表格，找到第一个promoter，长度在 2000bp 左右。 然后点击最右侧 Show 旁边的+，出现的就是启动子区的序列了 将序列信息复制，然后就可以进入下一步 MSP 引物设计 打开 MSP 在线引物设计工具页面： .urogene.org/methprimer/ 或者他们新开发的 2.0 页面.urogene.org/methprimer2/ 进入后我们选择第一个就好 进入引物设计页面后，我们把上一步得到的启动子区序列复制进这个大框框里，然后勾选箭 头标示的两个选框，没有其他特殊要求其他部分均按默认选项设置就好。然后点击submit。 新生成的页面中会有 CpG 岛的预测，后续如果还有其他引物要设计，可能需要这些信息。将页面继续下拉即出现设计好的引物啦 我们通常没有特殊要求选择第一对引物就可以。要注意MSP 需要两对引物，分别针对被甲基化的基因序列和没有被甲基化的。将序列复制下来加入实验设计，done. 当然如果第一对引物不 work，建议一次把多组引物都保存下来，以备不时之需。