流式细胞术原理及应用39235.pptxVIP

流式细胞术原理及应用39235;一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造 二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用;一、流式细胞术基本概念;第4页/共62页;流式细胞仪构造图;流式细胞仪五大系统;流动室与液流驱动系统;激光光源与光束成形系统;光学系统;信号检测与分析系统;;阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。 FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。;荧光信号 细胞自发荧光 特异荧光素标记激发的荧光信号 荧光信号的线性测量和对数测量---光电倍增管 1）检测光子，转换成电信号 2）将电信号等比例的放大 荧光信号的面积、宽度和高度 ;由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放???可以使用线性或对数两种方式。 一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。;直方图（Distribution Histogram） 横坐标：道数 纵坐标：细胞数;细胞分选系统;第17页/共62页;二、荧光素;激发光谱：特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光 发射光谱：某一波长激发光引起荧光素发射的荧光;常用荧光素;常用荧光染料;三、如何设计流式实验;A、根据机器配置选择荧光素 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。 FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。 ;B、根据抗原表达强弱合理分配荧光素;高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、FoxP3-PE ;尽量选择光谱重叠小的荧光素，如FITC/PE-Cy7； 选择不同激光激发的荧光素，如FITC/APC，PE/APC；;D、尽量避免偶联染料使用带来的假阳性;3）流式试验对照设置;流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。 通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。 ;同型对照抗体：与实验染色??单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型 （Fc段相同，F（ab’）2段不同） 与染色的单克隆抗体： ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 ⑤但由未免疫动物血清纯化而来 用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产生的背景染色;C、阳性对照 Positive Control;什么是荧光补偿？纠正荧光素发射光谱重叠 为什么要进行补偿调节？;第33页/共62页;补偿调节方法：;什么样的补偿最合适？;准确补偿的重要性;补偿调节要合适; 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别染色 n色分析就要制备n 个补偿对照管;;;;HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病;科研应用;在肿瘤研究中的应用： 细胞凋亡的检测； 细胞周期分析； 细胞增殖研究； 荧光蛋白分析； 肿瘤干细胞的鉴定和功能分析； 循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析； 实体瘤细胞的检测分析（肿瘤组织解离成单细胞后）； 肿瘤细胞系表型分析； 细胞活性的检测； 。。。;在高通量检测和新药研发中的应用： 细胞功能变化的研究； 细胞周期和活性； 细胞凋亡； 细胞增殖； 新药研发； 培养基研发； 。。。;;细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等能染活细胞的DNA，但需紫外激光激发。 PI标记法检测细胞周期 需要乙醇固定增加细胞膜的通透性； 需要加RNase，去除RNA对DNA的干扰。 ;PI法检测细胞周期一般步骤： 收集单细胞悬液(1 ×106个)，缓慢加入1 ml预冷的70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。 离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇； 去上清后加入染色液(包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 ℃ 染色30min后上机检测。;;;小鼠精子单倍体细胞;亚二倍体(Sub-G1)峰的检测;4.2 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;PI常用于鉴