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基因工程技术演示第1页/共15页 1、反转录PCR(RT-PCR)　 2、反向PCR3、复合PCR　　4、不对称PCR 　5、嵌套PCR6、实时定量PCRPCR的技术类型第2页/共15页 PCR技术的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第3页/共15页 PCR的操作步骤①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。注:每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍第4页/共15页 PCR的反应体系1、缓冲溶液 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂 2、耐热DNA聚合酶3、脱氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs)4、模板DNA5、上游引物、下游引物第5页/共15页 （1）、PCR反应缓冲液①Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。②1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。③Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。④Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、⑤EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第6页/共15页 （2）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-5 U/100?L 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（3）dNTP ①dNTP浓度取决于扩增片段的长度 ② 四种dNTP浓度应相等,一般为50-200?mol/L ③浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量 ④dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。第7页/共15页 （4）模板 ①单、双链DNA均可。 ② 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、 DNA结合蛋白类。 ③一般100ng DNA模板/100?L。 ④模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（5）引物浓度 0.1-1?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。第8页/共15页 PCR引物的设计原则①引物长度一般以15～30bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。②避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。③G/C和A/T碱基均匀分布， G/C含量在45～55%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。④要避免两个引物间特别是3′末端碱基序列互补以及同一引物自身3′末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。⑤引物3′末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3′末端为G、C或T时引发效率较高。⑥引物5`末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。第9页/共15页 PCR循环的一般参数（1）变性 使双链DNA解链为单链,95℃ 3～5分钟 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定, 适宜的退火温度大约低于引物Tm值45-55℃ ，介于45-55℃ 。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。（3）延伸 72℃，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加第10页/共15页 标准的PCR反应条件10×缓冲液　 10 μL4种dNTP混合物 各200umol/L引物 　　　 各10～100pmol模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶 2.5UMg