zj基因工程第3章(载体).pptVIP

大肠杆菌的λ噬菌体DNA 生物学特性： λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 λ噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 λ-DNA全长48,502个核苷酸 λ-DNA上至少有61个基因 目前六十二页\总数一百零三页\编于十七点 目前六十三页\总数一百零三页\编于十七点 λ噬菌体的结构和用途 λ噬菌体为线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48,531bp。 目前六十四页\总数一百零三页\编于十七点 λ噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和N、CI基因， O-R 为裂解区. 目前六十五页\总数一百零三页\编于十七点 目前六十六页\总数一百零三页\编于十七点 λ噬菌体的生活周期： 裂解λ侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。 目前六十七页\总数一百零三页\编于十七点 目前六十八页\总数一百零三页\编于十七点 目前六十九页\总数一百零三页\编于十七点 λ 噬菌体生物学特性：溶原状态 λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 目前七十页\总数一百零三页\编于十七点 构建λ噬菌体载体的基本内容： 1、除去λ-DNA上多余的限制酶识别位点； 2、切除掉λ-DNA的非必需区段； 3、引入适当的选择标记 4、引入无义突变 3.2 λ-DNA载体的构建 目前七十一页\总数一百零三页\编于十七点 3.2.1 删除重复的酶切位点 野生型的λ-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个；同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点；除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。 目前七十二页\总数一百零三页\编于十七点 根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 3.2.2 除去λ-DNA的非必需区段： 目前七十三页\总数一百零三页\编于十七点 pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上适合的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。 许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。 pBR322 质粒载体 目前三十页\总数一百零三页\编于十七点 有过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。 此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。 质粒载体 目前三十一页\总数一百零三页\编于十七点 启动子与转录调控 原核生物的转录单位是操纵子，操纵子包括相关结构基因及其上游的调控序列。 结构基因 调控序列 目前三十二页\总数一百零三页\编于十七点 操纵子 P：启动序列 O：操纵序列 I：调节序列 I P O CAP 调控区 Z Y X 结构基因 以乳糖操纵子（lac operon）为例： 目前三十三页\总数一百零三页\编于十七点 诱导物 Z Y X I P O CAP Z Y X I P O CAP 目前三十四页\总数一百零三页\编于十七点 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物 蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验） 目前三十五页\总数一百零三页\编于十七点 质粒载体 目前三十六页\总数一百零三页\编于十七点 质粒载体 目前三十七页\总数一百零三页\编于十七点 pUC质粒系列