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第1页/共59页麝香保心丸治疗性血管新生和系统生物学研究第2页/共59页提 要 冠心病的治疗，要解决血氧供需平衡，不是减少心肌耗氧，就是增加冠脉供血血管新生背景与概念血管新生的研究方法促进治疗性血管新生的方法麝香保心丸促血管新生研究第3页/共59页Judah Folkman （1933-2008）美国国家科学院院士，于70年代提出了肿瘤新生血管学说，该理论后被心血管领域应用于促血管新生研究治疗性血管新生研究背景Folkman在1970年代早期发现血管新生：肿瘤生长:血管生长因子与血管新生相关1983年, Kumar 等发现：心肌梗塞后有“血管生长因子” 1980年代中期，确定并纯化了多种与血管新生有关的多肽1994年 Jeff Isner’s 实验室倡导将血管生成用于心血管研究中。Ellis Unger’s 实验室发现应用促血管生成的蛋白质可以改善冠脉侧支。第4页/共59页侧支血管形成的种类微血管生长（Angiogenesis）血管发生（Vasculogenesis）动脉生成（Arteriogenesis） 三者的机理是不同的第5页/共59页血管新生(angiogenesis) 相当于废墟上重建 在缺血区域现有血管基础上通过芽生(sprouting)、分枝方式形成成熟的血管，由初级网状血管结构到复杂网状血管结构的过程。 血管内皮细胞基底膜降解、细胞外基质消化吸收。 内皮细胞向血管生长刺激物方向移行和增殖。 移行的血管内皮细胞伸展，彼此相连形成血管芽孢。 血管内皮细胞增殖使中空的管腔延长。第6页/共59页血管发生（Vasculogenesis）相当于原材料新建血管增生——来源于中胚层前体的内皮细胞原位分化、增殖形成初级毛细血管丛。血管重构——初级毛细血管形成互相连接、分支众多、成熟的血管结构。第7页/共59页动脉生成（Arteriogenesis）相当于休闲动脉的动员原有的侧支血管——正常心脏冠脉间存在的交通吻合血管，直径20至200μm ,呈薄壁样管状结构，通常状态下呈关闭状态。开放不仅仅是一个被动过程，开放后会出现一系列细胞生长因子分泌、DNA合成和细胞增殖 等血管主动生长过程。第8页/共59页治疗性血管新生（Therapeutic Angiogenesis ） 通过药物、基因治疗或其他手段促进冠状动脉的血管新生，以达到改善心肌缺血症状和患者预后的目的。手术搭桥（冠脉旁路血管移植术） 药物搭桥（药物促进的治疗性血管新生）第9页/共59页冠脉病变冠脉狭窄心肌缺血细胞活化减轻或防止心肌缺血坏死预防和延缓缺室壁瘤形成改善临床症状和预后生长因子：FGF,VEGF侧枝循环建立血管新生治疗性血管新生的意义增加供需失衡中的供给量第10页/共59页血管新生的研究方法和进展第11页/共59页筛选模型—鸡胚绒毛尿囊膜实验 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验 目前血管新生药物初步研究主要采用CAM 模型。CAM 作为一项研究体内血管效应的技术，实验材料易得、操作简便、实验周期短、结果易于观察，尤其适用于大批量血管效应药物的初步筛选。第12页/共59页动物急性心肌缺血模型 兔、鼠选择性冠状动脉结扎、栓塞造成动物缺血模型，给予干预后观察梗死周边区血管新生情况。大鼠心梗模型的制备第13页/共59页慢性心肌缺血模型3周后左冠造影狭窄明显、前向血流缓慢第14页/共59页血管内皮细胞培养血管内皮细胞培养：因为人脐静脉(HUV) 在某些方面具有与动脉生物学特征相似的优点，较之动物血管内皮更符合人体情况。增殖：MTT比色法迁移：Transwell小室体外成血管：体外血管生成试剂盒分泌：培养液内NO、VEGF人脐静脉内皮细胞培养第15页/共59页血管生长因子/抑制因子 干预因素对组织生长因子/抑制因子的影响生长因子：VEGF、 bFGF，TGF、促血管生成素-1（Ang-1）抑制因子：血管新生抑制素、内皮细胞抑制素、组织金属蛋白酶抑制剂、血栓反应素-1，2 (thrombospodin-12，TSP-12)、血小板因子-4(PF-4)等 缺血心肌中的VEGF染色颗粒第16页/共59页促进治疗性血管新生的方法促血管生长因子的应用干细胞移植药物干预第17页/共59页外源性输注生长因子目前，研究最广泛的血管生成生长因子家族为VEGF和FGF。给急性心肌梗死动物冠脉内注射bFGF，心肌梗死的面积显著缩小，缺血或梗塞心肌内毛细血管及小动脉数目增加。 VEGF是一种内皮细胞特异性有丝分裂原和活体血管新生诱导物。VEGF因其对内皮细胞作用的特异性而广泛应用于实验性肢体及心肌缺血的研究。 第18页/共59页导入生长因子基因 近来病毒介导的基因转染已作为一种血管形成生长因子释放的方法应用于慢性缺血动物模型。 VEGF基因，PDGF基因 将含VEGFcDNA的真核表达载体pV