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琼脂糖凝胶电泳示意图 血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白鸡的红细胞人的红细胞 (一)蛋白质分离和提取的原理一.基础知识根据蛋白质各种特性的差异：分子的形状、大小电荷性质和多少溶解度 吸附性质对其他分子亲和力 （二）蛋白质提取和分离的方法凝胶色谱法：又称分配色谱法电泳法 1.凝胶色谱法2）材料：凝胶(分配色谱法)1）概念 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法 凝胶是微小的多孔性球体，多糖类化合物如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。 3）凝胶色谱法的原理—分子筛效应 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 4）分离过程 混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收 集大分子收 集小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 2.电泳1)概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程 琼脂糖凝胶电泳示意图2)原理 分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3)类型:琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳4)实例：SDS——聚丙稀酰胺凝胶电泳用途: 测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度原理：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 讨论：如何测定蛋白质的分子量？ 使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。 (三)缓冲溶液 抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变1.作用如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4 说出人体血液中缓冲液 2.配制 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 3.提问：在本课题中使用的缓冲液是磷酸缓冲液 二.实验操作(1)红细胞的洗涤(2)血红蛋白的释放(3)分离血红蛋白溶液样品处理粗分离纯化纯度鉴定透析除去分子较小的杂质通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度跳转 红细胞1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：血液100mL低速离心2 min红细胞血 浆5倍体积生理盐水搅拌10min3g柠檬酸钠吸出血浆重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入 了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂 3.分离血红蛋白红细胞破碎混合液高速离心10min （无色透明）（白色薄层固体）（红色透明液体）（暗红色）用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 粗分离——透析除去样品中分子量较小的杂质①过程②透析目的20mmol/L磷酸缓冲液1mL 纯化——凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作2.凝胶色谱柱的装填3.样品的加入和洗脱 注意事项1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3. 色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。为什么？ 教学资料整理仅供参考，