细胞免疫组化.docx

细胞免疫组化 细胞爬片的免疫组化 细胞爬片，5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。 PBS 清洗标本 3 次 各 1 min。 3 .冰丙酮固定 15 min(或 4%多聚甲醛固定 30min)。 空气干燥 5min。 PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。 0.5%Triton X-100( DPBS 配 ) 孵育 1 次 20min。 PBS 清洗标本 3 次 各 2 min。 8 .3%H2O2（试剂 A）孵育 15 min。 DPBS 清洗标本 3 次 各 2 min。 封闭血清孵育（试剂 B） 20min。 11 .一抗孵育（滴度 1：200，湿盒）4℃ 过夜或 37℃60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用 PBS 液 12. PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。 .二抗工作液孵育（湿盒试剂 C） 37℃30 min。 .PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。 15. 试剂 D（湿盒） 37℃ 30 min。16、PBS 清洗标本 3 次 各 5 min。 17、DAB 显色（避光，镜下观察至棕色 ） 约 3~10min。 18、蒸馏水洗 2 次 1 min。 19、苏木素复染 0.5~1min。 20、自来水洗返蓝。 ——仅供参考 ——仅供参考 ——仅供参考 21.梯度酒精脱水 75，85，95，100%各 3min。 22.二甲苯透明 2 次 3min。 23、中性树胶封片。注意事项： 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须 注意以下： a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达 5 天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片； b 接种的细胞密度适中以 2*104/ml 为宜，若密度太高 5 天后细胞连接成片冲洗时易脱片； 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于 4C 冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩， 可用 80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片） 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100 表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使 其破坏细胞膜而核膜破坏较少。 细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？ 如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候 要防止脱落。 如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在 24 孔，或 6 孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。 孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲 苯透明、封片（可用甘油）。 细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬 片。 我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这 样做很少掉片。 先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面张力，细胞悬 液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概贴壁后，不同细胞贴壁时间稍 有不同，大概 6、7 个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下，到固定时细胞生长到 80％左右比较合适。 偶是在盖玻片上做的， 首先细胞要爬的匀一些，象 dongwp 战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。 擦干盖玻片的背面，在玻片背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。 细胞爬片的保存和抗原修复问题总结 细胞爬片可以用 含 叠氮钠 PBS 液保存.但不知道具体浓度,请告知.多谢!! 0.04--0.08%。但是我 建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题! louischen wrote:但我的细胞爬片经过 4%多聚甲醛固定，PBS 冲洗后直接就放在了-20 度，还能用于免疫组化吗?! mRNA 原位杂交经 4%多聚甲醛固定,固定液需加 DEPC 水。其它建议用甲醇固定。-20 度保存 如果是 4%多聚甲醛固定，然后放在 PBS 中保存，在 4 度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。 丙酮中固定 5-10 分钟，然后风干，放置4 度保存过夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组 化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用 0.5%的triton-100 孵育 30 分钟，渗透细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会 丙酮固定后，PBS 洗涤 3 次，即可保存至 4 度冰箱备用。 (1)细胞爬片先用 TBS 洗 3 次，每次 5 分钟(2)4%多聚甲醛固定，室温，20 分钟 (3)7