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流式细胞仪 技术; FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。;;第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 第二节 数据的显示与分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用;; 1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。 3、数据处理系统 ;;;;;;;（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关 （二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关;;;;;; 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 （一）光信号测量 线性放大器 对数放大器;;;;;（一）分选的基本原理;阳性选择;1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率 ; 分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原 细胞样品中该亚群细胞数的百分比。;第二节 数据的显示和分析;二、数据的显示方式;;;第32页/共79页;第33页/共79页;(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays; 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞; 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。;;;;1 、Region设置;2 、 设置; 样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的重复性 质量控制; 细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂 ;第44页/共79页;;; 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。; 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。; 机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能 少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光 染色处理不受影响。 ;防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。 ; 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 （一）免疫荧光标记最常用的荧光染料; 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在 488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光 染料产生的荧光信号。;荧光染料与细胞成分的结合方式： 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式 1、直接免疫荧光染色 2、间接免疫荧光染色;3、双或多参数荧光抗体的组合标记; FITC的激发 波长处于自发 荧光的光谱区 内，因此FITC 荧光易受自发 荧光的干扰。;（一）单细胞悬液制备的质量控制 （二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响 （三）仪器操作技术的质量控制; 1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为 同型对照（阴性对照） 2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、 洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影 响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控， 使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。 ;一、淋巴细胞及其亚群的分析 淋巴细胞是机体免疫系 统中的一群重要细胞群， 是参与免疫调节和执行细 胞免疫功能的免疫活性细 胞，T细胞、B细胞和NK 细胞，各自发挥不同的作 用。;;1、Th 细胞： CD3+ CD4 + CD8- T细胞，能辅助B 细胞分化成熟生 成抗体产生细胞 （桨细胞），参 与促进细胞介导 的免疫应答。;;;; ;流式细胞细胞因子分析图;流式细胞细胞因子分析图;三、淋巴造血系统分化抗原 及白血病