基因工程中工具酶限制酶的应用.pptxVIP

基因工程中工具酶限制酶的应用第1页/共85页 徐师大-屈艾老师制作2基因工程工具酶“工若善其事，必先利其器”。基因工程的操作，是分子水平的操作，它涉及到一系列相互关连的酶促反应，要靠一些重要酶类作工具，对基因进行人工切割和拼接，故称为“工具酶”。已知有许多酶在基因克隆实验中有着广泛的用途。工具酶是从哪里获得的呢？第2页/共85页 徐师大-屈艾老师制作3基因工程工具酶自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类即获得了最好的基因工程“工具”。以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合成酶类、核酸修饰酶类第3页/共85页 徐师大-屈艾老师制作4第4页/共85页 徐师大-屈艾老师制作5第一节限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题） 一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化第5页/共85页 徐师大-屈艾老师制作6一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现1．限制性核酸内切酶： ---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可识别230种不同的DNA序列。2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰(Modification)系统（R-M系统）。第6页/共85页 徐师大-屈艾老师制作7 在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌； 而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。第7页/共85页 徐师大-屈艾老师制作8l第8页/共85页 徐师大-屈艾老师制作9第9页/共85页 徐师大-屈艾老师制作10二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 1、类型 特性（7项）I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶 具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单链多肽 2种不同的亚基 第10页/共85页 徐师大-屈艾老师制作11切割位点距离识别位点的情况在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点内或其两侧?距寄主特异性位点3，端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割 能 能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大第11页/共85页 徐师大-屈艾老师制作122、切割频率 ---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。有了它，又知道DNA序列的长度，就可以估算该限制性核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数N。 但前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、识别序列在DNA分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果某限制性核酸内切第12页/共85页 徐师大-屈艾老师制作13酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。 当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。第13页/共85页 徐师大-屈艾老师制作14三．核酸内切限制酶的命名原则 由于发现了大量的限制酶，所以需要有一个统一的命名法。H．O．Smith和D．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者所接受。他们建议的命名