生物技术制药基因工程制药.pptxVIP

生物技术制药基因工程制药;第一节 概 述 ; 生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于新型生物药物的研制。之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等）以及某些疫苗，由于①材料来源困难；②提取技术问题；或③因为造价太高使患者望而却步；或④由于免疫抗原等缘故使传统生物药物的使用受到限制 而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面取得明显效果，它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂 ; 基因工程技术在医药行业中为预防、诊断、治疗癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病等疑难病方面提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂；利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽 ①免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体 ②细胞因子：如干扰素、白介素、生长因子 ③激素：如胰岛素、生长激素 ④酶类：如尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶 ;二、利用基因工程技术生产药物的优点 ; 我国基因工程药物研究和开发起步较晚，基础较差，重点放在运用现代生物技术手段开发化学合成法难以生产的医药产品，如1997年，我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技产品——α1b性干扰素;第二节 基因工程药物生产的基本过程 ; 就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术 通过基因工程技术，可以大规模生产很多从自然界很难或不能获得的蛋白质或多肽类物质。如以E.Coli为宿主，表达病毒抗原基因，获得病毒抗原，再通过一定手段除去抗原的反应性，而保留抗原原性，就得到了病毒疫苗 ;第9页/共124页;二、基因工程药物生产的主要程序;附：制备基因工程药物的一般程序 ;说 明;第三节 目的基因的获得 ; 对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而真??生物的目的基因不能进行直接分离 ①真核细胞中基因总量较大，单拷贝目的基因只是染色体DNA中很小的一部分，直接分离纯化极为困难；另外，②真核基因一般都有内含子，若以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA ，因此不能直接克隆真核基因。 克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法 ;一、逆转录法 ; 细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸(polyA)组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA; mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件; 先用碱解或核酸酶酶解(RNaseH 酶活性)的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA ; 载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译 合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。互补DNA插入片段小于10千碱基对，可选用质粒载体，如大于10千碱基对则选用噬菌体作为载体 ;（1）载体的分类;（2）载体的特点;（3）cDNA与载体的连接;5.将重组体导入宿主细胞;6.cDNA文库的鉴定;7.目的cDNA克隆的分离纯化;二、化学合成法 ;第四节 基 因 表 达 ;是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程 用基因工程制备药物，必须使目的基因进行高效表达 ;二、宿主细胞的选择 ;（二）宿主细胞的分类 ;（1）大肠杆菌 生长迅速、对其遗传学背景研究比较深入、透彻，所以是目前基因工程研究中最常用的原核表达体系 特点：①产物多为胞内产物（因为大肠杆菌的表达产物不存在信号肽） ②真核蛋白质常以不溶性包含体的形式存在（故下游处理过程必须经过复 杂的变性和复性等工艺才能恢复其生理活性）