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细胞表型实验介绍第1页/共24页 细胞表型实验介8月30日第2页/共24页 目录研究内容目的与意义实验原理实验过程结果分析3第3页/共24页 细胞表型实验定义：由基因型所产生的细胞的物理表观和可观察到的性质。研究主要内容：细胞凋亡、周期、迁移、侵袭、趋化、增殖、生长等。细胞表型分析目的意义： 检测细胞的表型，可以帮助了解相关基因、蛋白、药物的机理，是科学研究不可或缺的手段。4第4页/共24页 1.细胞凋亡、周期细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。依次经过G1-S-G2/M，不同时期的细胞内部经历精确的调控，反应相应的机理。研究细胞周期的变化，有利于了解基因、蛋白、药物对细胞周期产生的影响，进而指导科研工作。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。5第5页/共24页 流式细胞术61定义：是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 2.特点测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞可进行多参数测量在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。BD-Calibur BD FACSVantage第6页/共24页 流式细胞作用机制7分析系统光学系统液流系统检测系统喷嘴FluorescencesignalsFocused laserbeam鞘液第7页/共24页 流式细胞仪可检测到的细胞参数8非荧光信号前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积。 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性颗粒度细胞大小第8页/共24页 荧光信号9荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3。第9页/共24页 荧光信号与细胞特性10荧光染料被激发而发射的光信号。定量染色荧光信号大小被标记组分含量的定量多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量第10页/共24页 11二色镜 1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光，荧光第11页/共24页 流式结果分析12散点图 密度图二维等高图报告中常见的几种流式细胞图直方图第12页/共24页 细胞周期13流式细胞仪PI染色法检测细胞周期细胞内的DNA和RNA都可以和PI结合,实验前需用RNase将RNA消化后进行检测。细胞培养细胞周期同步细胞加药细胞固定PI染色流式上机数据分析PI：碘化丙啶第13页/共24页 14细胞凋亡Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡UL：上左区；一般认为是死亡细胞,UR：上右区；认为是晚期凋亡细胞, LL：下左区； 正常阴性细胞,LR：下右区; 早期凋亡细胞,ps:磷脂酰丝氨酸Annexin-V:Ca2+依赖性磷脂结合蛋白第14页/共24页 2.细胞迁移划痕实验:细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。15①第15页/共24页 16②③④第16页/共24页 3.细胞侵袭 细胞侵袭:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或实验设定的药物或者影响因子，肿瘤细胞在侵袭能力较强的情况下，会分泌相关酶类消化基质胶，从而从上室迁移到下室，通过计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。17第17页/共24页 Transwell18这是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层的一张有通透性的膜，这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。Transwell 小室第18页/共24页 细胞侵袭19实验实例：孵育24h第19页/共24页 4.细胞增殖（克隆形成）20单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力强弱。细胞培养环境的改变或药物、基因等外源性因素的作用能导致细胞克隆形成能力以及细胞集落的大小发生改变。细胞感染克隆形成细胞固定细胞染色克隆计数第20页/共24页 5.细胞生长（MTT法）MTT甲瓒SDHDMSO490