微生物遗传试验.pptxVIP

微生物遗传试验第1页/共26页 微生物遗传学实验第2页/共26页 紫外线(U、V)诱变——营养缺陷型筛选实验目的掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理学习筛选、检出、鉴定营养缺陷型的方法第3页/共26页 实验原理根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物等因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度。又根据基因突变的规律，即微生物的基因突变与环境条件没有直接对应的关系，要想得到某一特定类型的突变株，关键不是选用某种特定的诱变剂，而是采用特定的筛选方法。第4页/共26页 为了得到大肠杆菌的某一营养缺陷型，本实验以U．V作为诱变因素，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。又根据营养缺陷型在基本(MM)培养基上不能生长，只有在完全(CM)或(MM)培养基上加上它所缺陷的那种物质才能生长的原理，我们采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，最后用生长谱法加以鉴定。第5页/共26页 本实验要掌握的基本概念包括： 完全培养基，基本培养基，野生型菌株， 缺陷型菌株，诱变育种，诱变因素。诱变育种：根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物的因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选人们所需要的菌株，这一过程称诱变育种。诱变因素：凡是能引起微生物突变或是将突变频率提高到自发突变水平以上的因素称诱变因素。第6页/共26页 U．V诱变的原理U．V作用机制 照射剂量绝对剂量：以单位面积接受的能量进行计算(尔格／mm2或伦琴／mm2)。相对剂量：表示的方法很多——照射时间、距离、杀菌率等。一般实验中微生物受U.V照射的剂量方法是采用相对剂量，即固定紫外灯管的功率(15W-20W)，固定距离(30cm)照射不同时间，也有采用杀菌率作为相对剂量的。 第7页/共26页 U．V处理的条件细菌一定要成单细胞状态、均匀的悬浮液。真菌和放线菌一般处理孢子悬液。处理细菌细胞时，浓度一般为108／ml，并且以对数生长期为好，处理真菌和放线菌的孢子时，浓度为106／ml。处理的菌液都以生理盐水配制。U．V照射后的处理 避光培养要进行饥饿培养(考虑表型迟延作用) 第8页/共26页 营养缺陷型筛选的步骤(按图操作)E.Coli K128ml肉汤37℃振荡培养14～16hrs添加新鲜肉汤8ml，分装2只转入离心管，4000rpm离心5分钟1.菌体制备第9页/共26页 2.杀菌曲线制作和诱变处理先打匀沉淀，各加8ml生理盐水分装到5个皿，每皿3mlUV处理（不同剂量）向其中一个60s处理添加3ml2×肉汤37℃避光培养12hrs在红灯下操作，将不同处理时间的菌液涂LB平板，避光培养12hrs计数，制备杀菌曲线4000rpm离心5min，用生理盐水洗涤3次取0.1ml洗涤干净的菌液加入到无氮5ml无氮培养基37℃，12hrs饥饿培养第10页/共26页 3.青霉素淘汰野生型5ml 2×氮培养基加青霉素到终浓度500U/ml12hrs、16hrs、24hrs分别取样0.1ml，涂布MM和CM培养基，培养36～48hrs每个时段涂布8~6个完全培养基平板和1个基本培养基平板 8+1 8+1 6+1第11页/共26页 4.缺陷型检出取青霉素法CM和MM培养基上菌落数量差异最大的那一组，从CM板上用无菌牙签点种100个菌落到MM和CM培养基上，37℃12hrs培养。MMCMMMCM复证接种5ml肉汤第12页/共26页 5.生长谱鉴定5ml肉汤将可能的缺陷型菌落接入肉汤，37℃培养14～16hrs。4000rpm离心5min，洗涤3次取菌液1ml，混菌于基本培养基皿底划格，各区放入混合氨基酸等，培养24hrs，观察生长圈第13页/共26页 第14页/共26页 培养基完全培养基和2×肉汤 每组以1500ml的量称取药品。先加750ml水溶解，调节pH＝7.5，取3ml于试管中即为2×肉汤，每组2支。余下添加744ml水，摇匀，分装6个三角瓶，每瓶200ml，并在瓶内加入2％的琼脂粉。剩余的液体培养基分装2个三角瓶，是为肉汤培养基。基本培养基10×A缓冲液100ml：K2HPO4 10.5g，KH2PO4 4.5g，(NH4)2SO4 1.0g，柠檬酸钠0.5g20%葡萄糖50ml0.25mol/LMgSO4 : 100ml素琼脂每组2瓶：进口琼脂粉3.5g＋175ml蒸馏水。临用前融化素琼脂，添加20ml 10×A缓冲液、20％葡萄糖4ml， MgSO4 1ml混合倒皿。无氮培养基 每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。2×氮培养基每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。无N培养基配方(100ml)：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，葡萄糖2g，柠檬酸钠0