实验八酵母RNA的提取及成分鉴定浓盐法.pptxVIP

实验八酵母RNA的提取及成分鉴定浓盐法第1页/共21页 实验八酵母RNA的提取及 成分鉴定（浓盐法）第2页/共21页 实验目的 掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法 了解RNA成分鉴定的原理及其方法第3页/共21页 实验原理 核酸的分类与分布 DNA：主要存在于细胞核的染色体中, 线粒体、叶绿体、质粒有少量 RNA：存在于细胞质中第4页/共21页 样本的选择： 酵母RNA（RNA占干重的3%-10%） 制备方法： 稀碱法、浓盐法第5页/共21页 破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质?V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 制备过程： 第6页/共21页 RNA以可溶性钠盐的形式游离析出离心去除菌体,收集上清液,调至RNA的等电点（pH2～2.5）使RNA沉淀析出，离心收集沉淀乙醚洗涤沉淀、去除杂质、提纯RNA浓盐加热使酵母细胞壁破裂，蛋白质变性沉淀 RNA提取方法(浓盐法)第7页/共21页 RNA成分鉴定RNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解：第8页/共21页 1. 磷酸鉴定通过鉴定RNA的三种水解产物来鉴定RNA:钼酸铵磷钼酸+FeSO4钼蓝（蓝色）第9页/共21页 2. 碱基(嘌呤)鉴定第10页/共21页 3. 核糖鉴定5-甲基间苯二酚（蓝绿色）糠醛第11页/共21页 仪器试剂 仪器精密pH试纸（pH0.5～5.0）、广泛pH试纸（pH1～14）、冰块、锥形瓶、离心机、天平、电炉 干酵母、10％NaCl、6M HCl、冰块、5％氨水、(NH4)2MoO4 试剂第12页/共21页 实验操作 酵母RNA提取（4人一组） 1. 酵母破壁：10％NaCl(40mL)100mL锥形瓶煮沸加入干酵母（一勺）沸水浴40min取出冷却玻棒搅匀第13页/共21页 取出锥形瓶自来水冷却后转入50mL离心管3500rpm离心 5min取上清2.离心分离RNA两两平衡后对称放入离心机中第14页/共21页 3.沉淀提纯RNA 将上清液转入小烧杯中（不可带入沉淀）冰浴中冷却用6M HCL调 pH值至 2.0～2.5(RNA等电点)冰浴中静置5-10min（可见烧杯底部有大量沉淀）轻轻摇匀后转入离心管，两两平衡后对称放入离心机3500rpm离心5min，并收集沉淀精密试纸如何调pH值？2.0第15页/共21页 RNA成分鉴定溶解RNA2. 水解RNA（此处开始2人一组）加22d 1.5M H2SO4沸水浴10min取5ml RNA至大试管 溶液澄清加1d蒸馏水 搅成糊状 加10ml蒸馏水搅匀 加5%氨水至pH6-7，继续滴加至沉淀完全溶解广泛试纸第16页/共21页 核糖鉴定：20d水解液+20d Fe3+·HCL+2d 5%的5-甲基间苯二酚3. RNA成分鉴定嘌呤鉴定：20d水解液+20d 0.1mol AgNO3磷酸鉴定：20d水解液+20d钼酸铵 +FeSO4结晶粉加浓氨水至沉淀消失+10d 浓氨水沸水浴15min摇匀沸水浴2min沸水浴2-3min？？？（绿豆大小）第17页/共21页 离心机的使用方法1.选择合适的离心管2.使用天平对所离心样本（包括离心套筒）称量配平3.打开离心机电源，设定离心速度和离心时间4.按“停止”键打开离心机盖子，将样本按中心对称放置5.盖紧盖子，按“离心”键启动离心6.离心结束后，待仪器完全停止转动后方可打开盖子取出离心管第18页/共21页 实验结果 1 2 31号：磷酸鉴定（蓝色）2号：碱基鉴定（红棕色）3号：核糖鉴定（蓝绿色）第19页/共21页 思考题 在酵母破壁时为什么只能水煮沸了以后再放入装有酵母和10% NaCl的三角瓶？ 本实验中两次调pH值的目的分别是什么？第20页/共21页 感谢您的欣赏第21页/共21页