冰冻切片技术.pptxVIP

冰冻切片技术;;概 述;冰冻切片优缺点;（二）缺 点 1．不容易做连续切片。 2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 3．不容易制作较薄的切片。 4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。 ;二、冰冻切片机的使用及注意事项 ;冰冻切片的制备;（2）固定组织的制备 ;（3）恒冷箱温度 ;（4）抗卷板 ?抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点。可凭经验调整刀对组织的角度，一般新刀为20℃ （5）切片机 ?操作程序：先接通电源，调定恒冷箱温度，调整切片刀的角度，调定切片厚度，标本置载台致冷达所需温度后，将其安放在切片机推进器上。即可切片。 恒冷箱视使用情况每周或每月清洁一次冰霜。 ;;操作方法及步骤： ; ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 ⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 ;⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。;不同组织如何切片及注意事项;3、淋巴结组织 淋巴结切片时，需贴附两张不同厚度的组织，分别为5μm和7μm，整个染色过程需保持切片湿润，封片时须用二甲苯透明。 4、甲状腺组织 甲状腺组织很脆，切片时会造成空洞，可用刷子或手触摸组织，并要减慢摇手速度；染色时不能过度冲水，以免甲状腺组织中胶质流失。 对甲状腺微小癌的组织，切片时要特别注意，肿物一旦暴露，应先贴附组织1-2张； 要避免将肿物修掉。 ;;冰冻切片的快速染色法 ;快速染色法 ;冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共5分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。;冰冻切片的免疫组化染色步骤;冰冻切片4~8um，冰冻切片后如不染色，必须自然风干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。PBS洗，5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×3。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。;;;