肉桂地链霉菌的发酵工艺优化.pptxVIP

肉桂地链霉菌的发酵工艺优化第1页/共38页第2页/共38页 底盘细胞ST021菌株培养 形成单菌落 发酵接合转移选取高产菌株作为底盘细 胞对底盘细胞的目标产物进行验证构建转化体系第3页/共38页ST021发酵工艺的优化种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1%发酵培养基：葡萄糖4.5%，豆粕粉4%，硫酸钠0.22%，硝酸钠0.22%，氯化锰0.033%，硫酸铝0.007%，硫酸亚铁0.01%，抗坏血酸0.00019%，硫酸氢二钾0.00075%，碳酸钙0.25%， PH 6.7-6.8第4页/共38页第一批发酵第六天测得ST021的效价为：0.32g/L第二批发酵第七天测得ST021的效价为：2.43g/L第5页/共38页存在问题培养1天后的种子液PH：8.05左右第一批培养6天后的发酵液PH：8.64第二批培养7天后的发酵液PH：7.251.发酵过程中PH过高第6页/共38页计划：1.继续优化ST021的发酵工艺，使其能够达到理想的效价。2.继续做ST021的结合转移，构建其转化体系。3.设计并敲除ST021聚酮合成基因，为埃霉素基因的导入做准备。 第7页/共38页1.ST021抗性筛选 将ST021分别划线于含有Apr、Kan、Chl、tsr菌素的高氏培养中，观察知ST021对Apr有抗性，部分对Kan有抗性。第8页/共38页第9页/共38页3.ST021转化体系的建立 1.与游离型质粒的结合转移 对ST021与W菌进行结合转移，将不同形态的菌落涂到含Apr和Nali的高氏培养基上，验证，然能生长。第10页/共38页2 整合型质粒的结合转移 将ST021与整合型质粒PIB进行结合转移，长出转化子，涂到含有Apr和Nali的高氏培养基上，仍能生长，待提基因组，验证整合到基因组的哪个位点上。 第11页/共38页ST021单菌落发酵 单菌落 发酵液PH 效价 ST021-N18.880.653g/L ST021-N28.440.509g/L ST021-N38.820.833g/L ST021-N47.328.676g/L ST021-N58.711.052g/L ST021-N68.8410.01g/L第12页/共38页不同浓度豆油发酵 豆油浓度 发酵液PH 效价 2%8.900.635g/L 4%8.441.729g/L 6%8.322.952g/L 补加豆油6.883.442g/L第13页/共38页ST021单菌落发酵 单菌落 发酵液PH 效价 N-7 9.06 N-8 9.00 N-9 8.98 N-10 9.02 N-11 8.74 0.789g/L第14页/共38页ST021-Kan单菌落发酵 单菌落 发酵液PH 效价 Kan-2 8.94 8.5g/L Kan-3 9.040.91g/L Kan-4 9.07 0.87g/L第15页/共38页 对之前筛选出来的高产菌株N4、N6、Kan-2重新进行发酵。 菌落 效价 N4-3 1.11g/L N6-3 1.00g/L Kan-3 2.052g/L第16页/共38页 菌落 发酵液PH 效价 N-4加豆油 6.93 2.52g/L N-6加豆油 7.21 4.38g/L对N-4、N-6补加豆油发酵，第七天测发酵效价第17页/共38页结合转移 对ST021与整合型质粒进行结合转移，长出疑似转化子，用pIB的验证引物进行验证，证明PIB已经整合到ST 021的基因组上。第18页/共38页Kan-2单菌落发酵 编号 PH 效价 1 9.20 1.64g/L 2 9.07 7.05g/L 3 9.24 2.83g/L 4 9.16 9.10g/L第19页/共38页N4单菌落发酵 编号 PH 效价 1 9.20 1.10g/L 2 8.85 16.20g/L 3 9.22 4.72g/L 4 9.16 2.12g/L第20页/共38页N6单菌落发酵 编号 PH 效价 1 9.23 5.87g/L 2 8.34 19.22g/L 3 9.21 2.67g/L 4 9.32 1.64g/L第21页/共38页Kan-2单菌落发酵 编号 PH 效价 2 8.63 ___ 3 8.96 0.676g/L 4 7.83 5.43g/L（ ? 135.71mg/25mL）第22页/共38页N4单菌落发酵 编号 PH 效价 1 8.83 ____ 2 6.65 5.71g/L 3 8.81 0.571g/L 4 8.95 0.556g/L第23页/共38页N6单