秀丽线虫生殖细胞凋亡检测.pdfVIP

四川大学实验报告 题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测 一．实验目的 : 1. 掌握检测凋亡细胞的方法 2. 学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤 二．实验原理 1.秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）：是一种无毒无害、可 以独立生存的线虫 。其个体小，成体仅 1.5 长，为雌雄同体 （hermaphrodites），雄性个体仅占群体的 0.2%，可自体受精或双 性生殖；在 20℃下平均生活史为 3.5 天，平均繁殖力为 300-350 个；但若与雄虫交配，可产生多达 1400 个以上的后代。1976 年， Sulston 和Horvitz 利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 研究发现，其约 13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认 识到细胞凋亡的遗传基础。 2.荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙（Acridine orange）作为 染色剂，该染料对细胞具有慢性毒性，致癌性强，由于凋亡细胞因 DNA 片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显 微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。 三．实验材料及设备 1 / 7 四川大学实验报告 1. 实验材料： a) 各品系秀丽隐杆线虫：N2 （实验组）, ced-1::gfp （方法对照组），ced- 3 （阴性对照） b) OP50 c) M9培养基 d) NGM培养基 2. 实验设备： a) 普通光学显微镜 b) 载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝 c) 暗箱 d) 吸水纸、滴管等 e) 荧光显微镜 四．实验方法及步骤 1.线虫接种、同步化 2.取样：在12孔板培养板上，每孔吸取900μL预先接入少量OP50 的M9培养基，每孔用铂金丝挑取培养20~30条成体线虫 3.染色：向N2与ced-3 品系中每孔加入250μg/mL吖啶橙100μL, 混匀后置于培养箱（避光）染色45~60min。 4.方法对照组观察：向ced-1::GFP 品系中加入1滴盐酸左旋咪唑， 麻痹线虫后在荧光显微镜下观察。 2 / 7 四川大学实验报告 5.恢复：将已染色的线虫吸出置于35mm培养基中，恢复45~60min， 使摄入的含染料的OP50排出。麻痹线虫并置于荧光显微镜下观察。 6.观察：上述三个品系用相同方法观察：蓝光激发，在20倍物镜中， 凋亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间长）或亮 橙色（染色时间短）（ ），未凋亡细胞 ced-1::GFP组凋亡细胞呈亮绿色 核为均匀的暗绿色。 五．实验结果 （一）方法对照组： 图 1方法对照组荧光显微镜观察结果 在方法对照组中可观察到 GFP 蛋白标记的凋亡细 胞的阳性结果：在生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡， 外沿颜色最深，内侧颜色浅，该品系无需染色，发出绿 3 / 7 四川大学实验报告 色荧光的是标记ced-1蛋白的GFP蛋白，会聚集在凋亡 细胞细胞膜上。 （二）实验组： 图 2实验组荧光显微镜观察结果 在实验组中能观察到吖啶橙标记的凋亡细胞的阳 性结果：呈现亮橙色的细胞结构，在20倍物镜中，凋 亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色（染色时间