大肠杆菌表达系统详细表格.pptVIP

大肠杆菌表达系统 1.大肠杆菌表达体系的组成 一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。 表达过程：包含启动子、目的基因编码序列和转录终止序列的载体进入受体细胞后，可以利用受体细胞的复制、转录和翻译体系表达产生目的蛋白。 1.1 大肠杆菌表达载体 1.1.1 组成部分 1.启动子： 最佳启动子具备的条件 第一 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 第三 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 2. 转录终止子 启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制，将这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象，叫做启动子封堵作用。 转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。 3. 核糖体结合位点 能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。 4. 转译起始序列 5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。 5. 转译增强子 显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率。 6. 转译终止子 mRNA转译终止必须存在终止密码子。 大肠杆菌格外偏爱使用终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率便会得到进一步的增强。 常用的大肠杆菌表达载体 1. Lac启动子的表达载体 2. Trp启动子的表达载体 3. PL启动子的表达载体 lac启动子：控制编码β-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。 理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都基本上具备了用作克隆基因表达载体的条件。这类表达载体的最突出的特点是，含有一条足够大的编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片断。因此，每当有一个克隆的外源DNA片断插入到这个启动子之后,仍保持着lacZ基因固有的读码结构时，这个重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质. 质粒的构建： 将含有lac启动子的HaeIII 酶切片断，经平末端连接，克隆到经EcoR1切割并对其粘性末端进行填补修复的pBR322质粒上。 PL启动子的表达载体 是一种最广泛使用大肠杆菌表达载体的启动子之一. λPL启动子：是负责λ DNA分子转录的启动子之一。λPL启动子是可以被 E. coli RNA聚合酶所识别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以被λcI基因产物所抑制。携带λPL启动子的载体使用温度敏感的E. coli cI突变体。在较低的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 λPL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。 pPLc24表达载体： 用来表达天然的蛋白质和融合的蛋白质。 这个质粒表达载体含有MS2-聚合酶基因开始的98个密码子，不具有转译起始密码子的外源片断也能实现表达。 在MS2-聚合酶基因下游，存在BamHI和HindIII 单切点。EcoRI单切点靠近λ PL启动子，处于转译起始密码子之前。 T7表达系统 大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬箘体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬箘体启动子的情况下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬箘体转录体系。最终受T7噬箘体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。 Cassettes和基因融合 　　 一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E. coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个cassette。　　某些cassett