激光共聚焦简化版.pptxVIP

激光共聚焦简化版;荧光标记技术;荧光发生的原理;荧光和荧光显微镜;二、荧光显微镜术的基本原理;;第7页/共36页;;激发的特异性差－－背景荧光高; 什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？ 共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） ? 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统;;共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置;;;;不同波长的激光光源如：340nm、488nm、543nm等;光电倍增管;激光扫描共聚焦显微镜应用领域;基本应用 定位、定量 三维重组 动态测量 活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化 测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的检测 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量 线粒体膜电位的测量 4.荧光漂白恢复（FRAP）技术 6.荧光能量共振转移（FRET）技术 ;1. 定位;荧光串色;最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照： 首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光，在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。;最简单的用来确定有无自发荧光的方法是使用与观察标记标本相同的仪器参数去观察一个未经染色的对照标本。 为了尽量排除荧光串色的影响，在实验中应注意以下几点： 尽量选择发射光谱较少重迭的荧光染料； 尽量选择吸收光谱较少重迭的荧光染料； 使用只能激发一种染料的激光线来扫描标本，并采用序列扫描的方法； 确保每种荧光染料的标记强度是一致的，即：不要将一种颜色标的太强或太弱； 确保荧光信号比自发荧光要强；;序列扫描的方法排除荧光串色;Z轴定位; 动态观察－蛋白转运;首先是染料的存在形式： 根据荧光染料的存在形式可以分为盐、甲基乙酸酯、和右旋糖酐等。 荧光染料的存在形式影响染料的装载方式、染料在细胞内的分布、以及染料在细胞内的保持。 盐和右旋糖酐形式的染料一般采取微电极注射的装载方式。以酯形式存在的染料可采用孵育的方法，使染料按浓度梯度被动的装载到细胞内，并被细胞内的酯酶剪切成细胞膜不通透的产物。; 原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光。 ;KCL诱导的细胞外Ca2+内流测量;Intensity;第31页/共36页;光漂白技术的基本原理是：使用强激光照射，将细胞内的一个区域内的荧光分子漂白，然后观察未漂白的荧光分子的运动。 GFP 是比较适合用于光漂白研究的荧光分子。 首先，它比较亮、稳定、在活细胞内没有毒性，在使用低激光强度拍摄图像时漂白较少。 其次，在使用高强度激光照射时，GFP的光漂白是非可逆的，并且 GFP 的光漂白不会造成细胞损伤。 分子融合技术将绿色荧光蛋白和特定蛋白分子融合，使得光漂白技术可以用于研究蛋白分子在细胞内的运动。;激发方式：单光子激发 观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光、近红外） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共轭聚焦、逐点成像 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处 理和定量分析 ;Leica TCS SP2双光子激光共聚焦扫描显微镜; 谢谢大家！;感谢观看!