蛋白质类药物的分离纯.pptxVIP

蛋白质类药物的分离纯;生产过程;● 来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； ● 分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。;; 蛋白质分子中存在游离氨基和羧基，具有两性解离性质。 当蛋白质溶液处于某pH时，蛋白质分子解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶液pH称为蛋白质的等电点pI。; 利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。; 蛋白质分子量很大，分子粒径为1～100nm，属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定亲水溶胶的两个重要因素。;③ 蛋白质的沉淀;;● 沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化， 在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。 ● 是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点 沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。 ● 去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活性。;;在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以是变性沉淀。 加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。;盐析 电泳 透析 层析 分子筛 超速离心;定 义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原 理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 优 点：Pr不变性，常用。;定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相 反方向泳动的现象叫电泳。 原理： ● Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可在电场中移动。 ● 不同Pr分子携带电荷量不同，分子大小也 不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。;电场中，带净电荷Q的粒子所受电荷引力： 溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻： 当F引=F阻时： ;● 粒子泳动速度V与场强E、粒子电量Q成正比； ● V与粒子半径r、溶液粘度η成反比； ● V与粒子形状有关。 非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力。;电泳过程示意图;第19页/共54页;A. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）;CH2=CH;常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点;;;板状电泳;B. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳;SDS的作用原理 ; 蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。 不同蛋白质-SDS复合物形状相似（长椭球状）。 电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合 物的大小，即取决于蛋白质分子量的大小，而 与蛋白质原来所带电荷量无关。 ;测定蛋白质分子量; 将已知分子量的标准蛋白质在SDS -聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。 测定未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，根据标准曲线求得其分子量。;;SDSseparates proteins by MW;③ 凝胶色谱;凝胶层析原理;凝胶色谱分离;第36页/共54页;第37页/共54页;第38页/共54页;第39页/共54页;;凝胶色谱分离的应用;分子量的测定;定义: 利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同电荷的Pr进行分离的方法。 分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素 ;原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分离。;带正电荷多蛋白紧密结合;离 子 交 换 色 谱;柱 层 析;⑤亲和层析法;;亲 和 色 谱;亲和层析的特点;⑥ 透析法（Dialysis）; 透析工作图;感谢您的欣赏