PTEN在血管重建早期作用.pptxVIP

PTEN在血管重建早期作用 第1页/共13页 研究背景及目的 磷酸酶PTEN是PI3K（磷脂酰肌醇-3-羟激酶）蛋白激酶B（Akt）信号通路的一种重要的生理学抑制剂，在过去的研究中，我们致力于研究在体内和体外情况下PTEN在血管急性损伤后VSMC凋亡方面的作用。然而，PTEN在血管成形术诱导的血管损伤的早期阶段的作用尚不明了。 为了明确该作用机制，我们设计该实验以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用。 第2页/共13页 技术路线 1.体内(颈动脉损伤模型构建) 2.体外： 成年Wistar大鼠（300g) 颈总动脉分离 未处理（对照） 球囊损伤 12h后 PTEN表达量检测 取材（HcASMC） 细胞培养至第六代 干预 24h 转染 共转染PTEN/活化 的Akt突变体 血清 不同生长因子 周期性拉伸装置 H2O2 WT-PTEN质粒 SiRNA 敲出PTEN基因 凋亡VSMC数量 检测、Akt磷酸化 检测 VSMC凋亡数量检测 3.汇总数据、统计分析、得出结论 PTEN表达量检测 第3页/共13页 实验结果报告：图1A-D 为了探究血管受损后PTEN的表达及细胞凋亡情况，研究人员对实验大鼠颈动脉进行球囊损伤，12小时后，免疫组化检测各项指标如上图： PTEN (green), apoptotic smooth muscle cells (TUNEL staining,red) and nuclei (DAPI, blue） 由图可知：球扩后损伤较严重的区域PTEN表达量较多，正常细胞数量少、凋亡细胞数量密集（图上半部分） 第4页/共13页 实验结果报告：图1E-F western blot：using a specific PTEN antibody 微管蛋白 不同时间点PTEN相对表达量 densitometric analysis of immunoblots 对经/未经球扩后的标本裂解后通过免疫 沉淀反应进行PTEN活性检测： Immunoprecipitations employing an IgG iso-antibody and without addition of any antibodies served as controls 由图可知：在大鼠颈动脉受损后12H内，PTEN的表达具有时间依赖性（递增） 与对照组相比，其活性明显高于未受损的大鼠颈动脉标本。 时间依赖性？ 第5页/共13页 第6页/共13页 第7页/共13页 实验结果报告：图4A-C A:Protein expression was determined by western blotting. Detection of Cdk4 served as a loading control. SMCtransfected with siRNA targeting PTEN or a scrambled control were incubated in basal medium in the absence (B) or presence of H2O2 (C). SMC were transfected as follows: non transfected(NT); mock transfected (without siRNA, but with lipid carrier); transfected with a non-targeting (scrambled) siRNA (Control siRNA); transfected with a targeting siRNA against PTEN (PTEN siRNA). 由图可知：与对照组相比，经siRNA敲出PTEN 基因之后，VSMC的PTEN表达量明显减少，凋 亡的SMC数量亦显著减少。 敲出PTEN基因后PTEN的表达及凋亡细胞数量变化 第8页/共13页 实验结果报告：图5A-C A：Akt磷酸化检测（western blot） An antibody against total Akt （Pan Akt）was used as control. B: PI3-K-inhibitor Ly294002 (50 nM) was supplemented to the medium for not-transfected cells. HcASMC weretransfected as follows: non transfected (NT); transfected with