基因克隆工具酶.pptxVIP

基因克隆工具酶;NMP NTP dNMP dNTP;一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）;一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）;作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（例如DH5α），必须是 （1）rec基因缺陷型的突变体 保证必须不与同外来DNA分子发生遗传重组 （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株 保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解 ;;Ⅱ型酶的作用方式在基因工程中具有十分重要的价值，是基因工程中常用的工具酶。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶的使用不如Ⅱ型酶方便，切割方式不如Ⅱ型酶那样令人满意，在基因克隆中实用价值不大。;;H：细菌属名的头一个字母 in：细菌种名的头两个字母 Hin：表示了该菌的物种名称，用斜体 d：代表该菌菌株名称 III：表示该菌具有几个不同的限制与修饰体系，Ⅲ表示该酶是属于第三个限制修饰系统的酶 ;;EcoRI等产生的5’粘性末端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRI 37 ℃;PstI等产生的3’粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 ℃;PvuII等产生的平头末端 5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’ PvuII 37 ℃;限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用。因此，甲种生物的DNA与乙种生物的DNA用同一种限制酶作用后，所形成的限制片段带有同样的末端，能够通过碱基的互补配对而连接起来。这是重组DNA技术的重要基础之一。根据这一特性，可以将不同来源的DNA重组成一种新的重组体分子。 限制酶切割DNA分子形成的短片段可以自发地重新连接成环状，这些环状分子经过加热又可以打开成线状 但如果在环化后加进DNA连接酶，在DNA片段之间的接口处将形成磷酸二酯键，这是一种较强的化学结合力，形成的环形DNA将是十分稳定的，即使再加热也很难再成线状，除非再次受到限制酶的作用。这说明，DNA经限制酶切割后再通过连接酶作用，得到的连接DNA是相当稳固的，这也是分子克隆技术的重要前提。 ;;;;;;;二、DNA连接酶（DNA ligase） 1.DNA连接酶的基本性质 （1）修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 催化5 -磷酸基团和3-羟基末端之间形成磷酸二酯键 ;二、DNA连接酶（DNA ligase） 1.DNA连接酶的基本性质 （2）修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C … 5’;二、DNA连接酶（DNA ligase） 1.DNA连接酶的基本性质 （3）连接多个平头双链DNA分子：;;二、DNA连接酶（DNA ligase） ;2+;32;;三、DNA聚合酶（DNA polymerase）;三、DNA聚合酶（DNA polymerase） 2. 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） ;32;三、DNA聚合酶（DNA polymerase） ;三、DNA聚合酶（DNA polymerase） 3.T4-DNA聚合酶 ;2+;;;;;;2+;;S1;;;A;;;;;实验技术——核酸凝胶电泳结果处理软件quantity one;感谢观看！