蛋白相互作用的研究技术分子生物学.pptxVIP

蛋白相互作用的研究技术分子生物学;蛋白质相互作用技术研究方法; 蛋白质是生命活动的主要执行者 蛋白质的功能主要通过与蛋白质以及其他生物分子的相互作用来实现 蛋白相互作用组学（interactomics) 相互作用 网络 功能; 举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物—蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。 ; ;生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 ; 蛋白相互作用组学是系统生物学各种”组”学研究技术的新分支，它通过系统研究生物体各种蛋白分子间的相互作用，发现和鉴别分子机器、途径和网络，构建类似集成电路的生物学功能模块，并在研究模块的相互作用基础上绘制生物体的相互作用图谱，由此将单个未知蛋白置于相互作用网络的不同功能模块中，通过已知功能蛋白的上下文来阅读未知蛋白的功能。 ;2001年 酵母双杂交 酵母的蛋白相互作用网络图 PNAS, 2001,98:4569-4574 Nat Genet, 2001,29:482-486 ;Fig. 3. Biologically intriguing interaction networks. The arrows indicate the orientation of each two-hybrid interaction, beginning from the bait to the prey. Hypothetical proteins of unknown functions are indicated by black ovals with white letters.;幽门螺杆菌(H. pylori) Nature, 2001, 409:211-215 秀丽隐杆线虫（C. elegans） Science, 2004,303:540-543 黑腹果蝇（D. melanogaster） Nature, 2007, 445:95-101 恶性疟原虫（P. falciparum） Nature, 2005,438:108-112 人类 Cell, 2005,122:957-968 分子机器，??号途径，代谢通路等。我国的人类肝脏蛋白质相互作用网络正在进行。 J Bacteriol, 2005,187:2233-2243 Plant Mol Biol, 2007,63:703-718 Mol Cell Proteomics, 2006,5: 2279-2297 ;第11页/共60页;;蛋白质亲和色谱protein affinity chromatography ?;融合蛋白pull-down实验; GST融合蛋白在经过固定有GSH(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用;; 以上两种方法都有共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能是由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可能是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。实验结果还应经其他方法验证。 ; 以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。该法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 ???? 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白，另外灵敏度不如亲和色谱高。;;在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有