细胞增殖CCK-8实验报告.docxVIP

CCK-8实验报告 前言 细胞增殖是生物体的重要生命特征，单细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体，多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。 图1 细胞增殖示意图 CCK-8常应用于检测细胞的增殖能力。CCK-8试剂中含有WST–8：化学名：2-(2- 甲氧基-4- 硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在 电子载体1-甲氧基-5-甲基 吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，用酶标仪在450nm波长处测定其吸光度值（OD值）来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 图2 CCK-8在细胞中的代谢 该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。其优点包括灵敏度高，数据可靠，重现性好，操作简便，省时省力，水溶性，不需要换液，对细胞毒性低等。 图3 不同数量细胞CCK-8检测的吸光度值 材料与方法 主要试剂 试剂名称 厂家 货号 胎牛血清 GIBCO 16000-044 RPMI-1640 Hyclone SH30809.01B 青链霉素混合液（100X） Solarbio P1400-100 胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%） Solarbio T1300-100 CCK-8 SAB CP002 溶液配制 PBS溶液：600ml的ddH2O中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液pH至7.4，定容至1L，滤器过滤后，高压灭菌，室温保存。 细胞株及培养条件 细胞株名称 来源 培养条件 主要仪器及耗材 仪器名称 厂家 型号 离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 TDZ4-WS 移液枪 吉尔森P型移液器公司 P2、P10、P20、P100、P200、P1000 酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司 DNM-9602 细胞培养耗材 TRUELINE TR4001、TR4002、TR5000 生物安全柜 苏州金净净化设备公司 BHC-1300IIB2 CO2恒温培养箱 Thermo Thermo Forma 3111 显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司 XDS-500C 实验步骤 细胞培养 HGC27、MKN45、AGS细胞采用含10％胎牛血清，1%双抗（青链霉素混合液）的RPMI-1640培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。显微镜下观察细胞为贴壁细胞。 实验过程 （1）将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化，显微镜下计数后制成3×104个细胞/ml的细胞悬液。分别取100μl至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，3×103个细胞/孔，以100μl培养液做空白对照，37℃培养过夜。接种4块板用于检测5个时间点的数据。 （2）实验分组如下： 敲减： siNC：细胞感染对照慢病毒 siGene-1：细胞感染Gene-1干扰慢病毒 siGene-2：细胞感染Gene-2干扰慢病毒 过表达 oeNC：细胞感染对照慢病毒 oeGene：细胞感染oeGene过表达慢病毒 回复实验 Vector+溶剂：细胞感染对照慢病毒+溶剂 oeGene（或siGene）+溶剂：细胞感染Gene过表达慢病毒（或Gene干扰慢病毒）+溶剂 Vector+抑制剂（或激动剂）：细胞感染对照慢病毒，联合抑制剂（或激动剂）处理 oeGene（或siGene）+抑制剂（或激动剂）：细胞感染GENE过表达慢病毒（或Gene-1干扰慢病毒），联合抑制剂（或激动剂）处理 （3）分别在0、24、48、72h后，按1:10 体积比混合Cell Counting Kit -8（CCK-8）和无血清必需基本培养基，每孔100μL 加入待测孔中，在37℃，5%CO2培养箱中孵育1 h； （4）用酶标仪测定450nm波长吸光度。记录每块板的数值。 实验结果 见附件。