蛋白质检测Western Blot实验报告.docxVIP

Western Blot 前言 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western（西）印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein（1964）和Davis（1964）设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl（pH6.8），上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3），分离胶中含Tris-Cl（pH8.8）的。系统中所有组分都含有0.1％的SDS（Laemmli, 1970），样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 实验材料： 所需试剂 试剂名称 试剂来源 货号 RIPA组织细胞快速裂解液 上海基尔顿生物 BYL40825 BCA蛋白定量试剂盒 thermo PICPI23223 30%丙烯酰胺（29：1） 上海基尔顿生物 BYL40857 1.0M Tris-HCl,pH=8.8电泳缓冲液 上海基尔顿生物 BYL40910 1.0M Tris-HCl,pH=6.8电泳缓冲液 上海基尔顿生物 BYL40908 10% SDS 上海基尔顿生物 BYL40944 10% 过硫酸铵 上海基尔顿生物 BYL40856 TEMED 上海基尔顿生物 BYL40728 4*蛋白上样缓冲液 上海基尔顿生物 BYL40828 蛋白预染Marker Fermentas SM1811 丽春红S 上海基尔顿生物 BYL40635 NC膜 millipore HATF00010 脱脂奶粉 BD分装 BYL40422 PBS磷酸盐缓冲液 上海基尔顿生物 BYL40657 Tween-20 吐温 -20 Amresco BYL40713 发光液 Millipore WBKLS0100 抗体信息 抗体名称 抗体来源 货号 TRIM37 Abcam Ab95997 c-myc Abcam Ab32072 Caspase3 Abcam Ab2302 ERK1/2 CST #9102 p-ERK1/2 CST #9101 GAPDH CST #5174 羊抗兔HRP标记二抗 碧云天 A0208 所需仪器 仪器名称 仪器来源 电泳仪 BIO－RAD 公司 型号 mini protean 3 cell 电转仪 PS-9，大连竞迈科技有限公司 酶标仪 芬兰雷勃酶标仪（型号为MK3） 移液器 吉尔森P型移液器(Pipetman) 水浴锅 Leica(莱卡公司) HI1210水浴锅 成像系统 Tanon Tanon-5200 操作流程： 样品准备 1.组织样品： 将组织剪成细小的碎片，按每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000g 离心15分钟，