聚合酶链反应 Real-Time PCR实验报告.docxVIP

Real-Time PCR实验报告 前言 聚合酶链反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。Real -Time PCR，即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，它是在PCR反应体系中加入荧光物质，并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来，广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。 实验材料 主要试剂 试剂名称 厂家 货号 Trizol invitrogen 1596-026 DEPC处理水 基尔顿生物 R1600 SYBR Green PCR试剂盒 Thermo #K0223 逆转录试剂盒 Fermentas #K1622 异丙醇 国药集团无水乙醇 国药集团 100092680 氯仿 国药集团溶液配制 DEPC水：在1000mL的ddH2O中加入1mLDEPC原液，磁力搅拌器搅拌过夜。 高压灭菌备用。 主要仪器及耗材 仪器名称 厂家 型号 Real-time检测仪 ABI公司 ABI-7300 低温冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 TG-16M 移液枪 吉尔森P型移液器公司 P2、P10、P20、P100、P200、P1000 旋涡振荡器 青浦泸西仪器厂 K30 电动匀浆机 FLUKO PRO200 离心管及10μL、200μL、1000μL枪头等常规耗材均为国产；RNA提取过程中所需的离心管、枪头等耗材经过0.1%的DEPC水浸泡过夜，121℃灭菌30min，烘干后备用。 实验步骤 总RNA的提取 取组织或者细胞于1mL的Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰上； 置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min； 吸上清于新的1.5mL离心管中，加入200μL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4℃，12000r/min，离心10min； 吸取上清于新的1.5mL离心管中，加入600μL的异丙醇，混合均匀，室温静置15min，4℃，12000r/min，离心15min，弃上清； 加入1mL75%的无水乙醇（750μL无水乙醇+250μL DEPC水）漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清； 加入1mL无水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥10min； 加入40μL的DEPC水溶解RNA，置于-80℃冰箱保存备用。 cDNA第一条链的合成 总RNA中DNA的消除 DNaseⅠ： 1 μL 10×DNaseⅠ Buffer： 1 μL 总RNA： ≦1 ?g DEPC-H2O： n μL 总体积： 10μL 37℃，30min；Hold，加1μL的EDTA；65℃，10min。 反转录 （1）按以下体系加入： RNA-Primer Mix： 12μL 5×RT Reaction Buffer： 5μL 25mM dNTPs： 1μL 25U/μL RNase Inhibitor ： 1μL 200U/μL M-MLV Rtase： 1μL Oligo(dt)18 or Specific Primer： 1μL ddH2O(DNase-free)： 4μL 总体积： 25μL 反应程序：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min；置于-20℃保存。 Real-time PCR扩增 将制备好的cDNA进行PCR扩增，扩增体系如下： SYBRGreen Mix 12.5μL 上游引物F 0.5μL 下游引物R 0.5μL ddH2O 9.5μL cDNA模板 2μL 总体积 25μL 反应程序： 95℃ ，10min（95℃，15Sec；60℃，45Sec）×40；95℃,15 Sec； 60℃,1min；95℃,15 Sec；60℃, 15 Sec