16株军团菌全基因组比较及重要毒力因子分析.docx

? ? 16株军团菌全基因组比较及重要毒力因子分析 ? ? 陈爱平,张拥军 军团菌是一种革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌,广泛存在于各种水体环境中,包括江、河、湖泊、冷却塔水、温泉、喷泉、加湿器、自来水等,已经分离鉴定至少59种,超过70个血清群。与人类疾病关系最密切的是嗜肺军团菌(Legionellapneumophila,LP),以血清1型军团菌(LPl)引发的军团菌肺炎最为常见,占85%;非嗜肺军团菌(非LP)引起人类感染的有米克戴德军团菌(L.micdadei)、博杰曼军团菌(L.bozemanae)、杜莫夫军团菌(L.dumoffii)、长滩军团菌(L.longbeachae)等[1-4]。 细菌全基因组(WGS)是精准鉴定生物遗传多样性的方法。运用各种生物信息学软件、生物学数据库,结合菌株的流行病学背景资料进行生物信息学分析,能够从多个角度较全面揭示病原菌的遗传特征。基于基因组序列的流行病学分析已经广泛运用于病原菌的分型鉴定,WGS更加全面、准确地描述不同来源分离株的遗传特征,精准确定菌株的克隆性和遗传相关性,揭示疫情相关菌株的传染来源、传播途径和流行规律等,已经成为传染病疫情分析、研判中重要的技术手段和趋势[1,5]。 本文通过生物信息学分析16株军团菌参考菌株基因序列,了解临床和外环境分离的军团菌、LP1与非LP之间的基因组特征,全面比较不同菌株的毒力因子、耐药基因、遗传差异和种系发生关系,从而深入认识不同军团菌的遗传特征、遗传联系以及潜在的致病性。 1 材料与方法 1.1 实验用参考菌株 从NCBI数据库中选择基因组序列完整、背景清楚、不同种以及不同来源(临床、外环境)的16株军团菌代表性参考菌株。选用的外环境非LP都是已知对人类有潜在致病性的。下载全长基因组序列,菌株信息见表1。包括5株LP1临床参考菌株:D-5387、Lens、NY23、Philadephia-1、Paris,3株 外 环 境LP1参 考 菌 株:Yu237、BJ-9、SZ2012007,4株不同种的外环境非LP参考菌株:NCTC11533、FDAARGOS_200、NCTC11988、NCTC11983,4株米克戴德临床参考菌株:2014LM、LMI、NZ2015、NZ2016。 表1 16株军团菌参考菌株信息一览表Tab.1 List of 16 Legionella species reference strains 表1 (续) 1.2 军团菌参考菌株全基因组功能注释 分别将16株参考菌株基因组序列导入RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology,/)服务器[6],逐一进行在线分析,下载各自的基因组注释结果并进行比较。 1.3 军团菌参考菌株多基因组比对 运用MAUVE软件(version,选择16株中的9株参考菌株进行多基因组比对[7]。对于存在多个重叠群记录的基因组序列,运用Mauve软件的move contigs功能,以线性的参考菌株Philadephia-1全基因组序列(GenBank登录号:NC_002942)作为参照,对这些基因组重叠群进行重排,最终以重排后的序列在MAUVE里完成多基因组比对。 1.4 基于16S r RNA基因的军团菌参考菌株种系发生 在RAST服务器确定本研究16株参考菌株的16S r RNA基因在全基因组中的位置,运用BioEdit软件(version 7.2.5)编辑所有菌株的16S r RNA基因序列,随后,运用MEGA软件(version 7.0.21)中最大似然法进行遗传进化和种系发生分析。 1.5 军团菌参考菌株毒力因子生物信息分析 选择16株中7株参考菌株,在VFDB(Virulence Factor of Pathogenic Bacteria)(/VFs/)服务器上运用VFanalyzer在线分析菌株所有潜在的毒力因子,导出结果并进行比较。 1.6 军团菌耐药基因生物信息分析 在CARD(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)(https://card.mcmaster.ca/genomes)服务器上分别预测分析16株参考菌株的耐药基因,导出每个菌株耐药基因预测结果并进行比较。 2 结果 2.1 军团菌参考菌株全基因组的功能注释 16株参考菌株基因组大小(3.13～4.23)Mbp。GC含量38.2%～41.7%,其 中8株LP1菌 株GC含 量38.2%～38.4%,4株临床分离的米克戴德GC含量40.5%～40.6%,4株 外 环 境 非LP菌 株GC含 量37.1%～41.7%。RAST服务器的特色就是将功能相似或相关的基因合并称为亚系统,1