吉林林蛙抗菌肽的分离纯化及抗菌剂的抗菌活性研究.docxVIP

吉林林蛙抗菌肽的分离纯化及抗菌剂的抗菌活性研究 食品的保存、保险和腐败一直是人们日常生活中的难题。最初人们采用淹渍 (糖、醋、盐等) 、熏制、干燥等手段解决这一问题, 但是它们严重影响食物的自然风味与口感。随着化学与微生物学的发展, 人们研发出如:亚硝酸钠、苯甲酸钠、苯甲酸等化学合成防腐剂, 而化学防腐剂具有一定的毒性。以亚硝酸钠为例:亚硝酸钠无论是在体内, 还是体外都能与肉类中的胺结合, 形成二甲基亚硝胺, 这是一种很强的致癌性物质, 因此人们开始寻找安全无毒的天然防腐剂。目前, 用于取代化学防腐剂对食物防腐与保鲜的物质主要有以下几类:1、菌体次级代谢物, 如:Lacticin 我们从吉林林蛙干皮中提取了几种抗菌组分, 它们抗菌谱较广 1 菌株和仪器 吉林林蛙;草莓市售;香肠长春市商业肉制品厂;大肠埃希氏菌Escherichia coli ATCC 25922, 粪链球菌S.faccalis ATCC 29212, 铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, 以上菌种均购自吉林省防疫站;Sephadex G-25Pharmacia biotch.公司;CM-52阳离子交换剂Sigma公司;LB液体培养基Luria-bertani Broth;溶菌酶购自Sigma公司;乙腈色谱纯;其余试剂均为国产分析纯。 TGL-16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂;752紫外分光光度计上海第三仪器分析厂;层析柜L K B 2 0 2 3Minicoldlab;HPLC仪WatersSHIMADZU-10A;HPLC层析柱Vydac C 2 方法和结果 2.1 不同峰对铜绿色假单孢菌的抗菌活性检测 取吉林林蛙干皮浸泡于适当抽提体系中, 匀浆, 离心, 取上清液得粗提物, 浓缩除盐后, 上CM-52纤维素柱, 以0.02mol/L p H4.0磷酸缓冲液淋洗收集透过峰, 然后分别用0.2、0.5、1.0mol/L磷酸缓冲液进行阶段性洗脱 (图1) , 收集峰1、2、3, 分别检测各峰对铜绿假单孢菌的抗菌活性 (表1) 。 表1表明透过峰相对抗菌活性较高, 收集透过峰用半制备HPLC进行进一步分离纯化 (图2) 。同样以铜绿色假单孢菌跟踪测活 (表2) 。 收集以上三个HPLC单峰 (图中以星号标记) 并测定了它们对铜绿色假单孢菌的抗菌活力, 结果如表2。 从表2看出:FSE-31.5具有较高抗菌活力, 而且收率较高, 利用半制备型RP-HPLC进行制备, 然后利用管碟法对收集的样品进行了几种具有代表性菌种的抗菌活性研究, 发现其具有较广的抗菌谱, 对Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pro-teus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillussublilis, Pseudomonas aeruginosa, S.faccalis等都有较好的抑制作用, 现举3例作为说明 (图3、4、5) 。 2.2 用获得的样品部分或全部替换现有的亚硝酸盐，以进行肠道腐败实验 2.2.1 抗菌肽部分代替亚硝酸钠, 实验结果见表3。 2.2.2 用抗菌肽部分或全部代替山梨酸钾, 实验结果见表4。 2.3 用获得的样品对草莓进行了保险测试。测试结果如表5所示 3 抗菌肽fse-31.5的制备 实验结果表明:从吉林林蛙干皮中提取的抗菌肽FSE-31.5对香肠、草莓均具有较好的防腐保鲜效果。根据中华人民共和国国家标准肉灌肠卫生标准 (GB 2725.1-1994) 规定香肠出厂总菌群数不大于2×10 同多数瓜果蔬菜相比草莓的表皮较为脆弱, 在运输保存过程中比较容易破损, 而造成微生物的侵袭污染, 已知草莓黑斑病菌 (Colletotrichum acutatum Simmonds) 、草莓红心病菌 (Phytophthora fragariae Hickman var.fragariae WilcoxDuncan) 是草莓的主要腐烂病菌, 在草莓的生长、运输、储存过程中带来较为严重的经济损失。通过表5, 可以看出喷洒了抗菌肽FSE-31.5的草莓能够保存120h而不腐烂, 对照组仅能保存72h, 我们将进一步对喷洒剂量、保存温度、湿度等条件进行探索研究。由于瓜果蔬菜与肉制食品不同, 肉制品污染菌种类相对简单, 而瓜果蔬菜分别有各自不同的腐烂病菌, 如:苹果的青霉菌 (Penicllium) ;桃的链核盘菌 (Monilinia) ;菠萝的果腐病 (Ceratocystis) ;葡萄的葡萄孢菌 (Botrytis) ;马铃薯的镰刀菌 (Fusarium) 、茎点霉菌 (Phoma) 、灰斑病 (Cercospora) 、长蠕孢菌 (Helminthosp