转基因食品安全分析课程第二部分转基因食品生物技术.pptVIP

2、免疫球蛋白的生物学特征 1）主要功能 V区：特异性识别、结合Ag C区：激活补体、调理作用、ADCC等 2）各类免疫球蛋白的特性和功能 当前第127页\共有186页\编于星期四\13点 IgG 血清和胞外液中的主要抗体成分，可通过经典途 径激活补体 自出生三个月开始合成，3-5岁接近成人水平。 是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用（新生儿抗感染）。 主要的抗感染抗体(具有抗菌、抗病毒、中和毒素和免疫调理作用)，参与II、III型超敏反应 当前第128页\共有186页\编于星期四\13点 IgM是个体发育中最早产生的抗体，胚胎晚期已能合成，新生儿脐带血中若IgM水平升高，提示胎儿曾有宫内感染 IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断 有很强的抗原结合能力，比IgG更易激活补体 也可参与II、III型超敏反应 IgM 当前第129页\共有186页\编于星期四\13点 分为血清型和分泌型两种。 sIgA主要存在于唾液、泪液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中 参与皮肤粘膜的局部抗感染作用 初乳中含有高浓度的sIgA----母乳喂养 IgA 当前第130页\共有186页\编于星期四\13点 一、抗体的制备 1、抗血清（多克隆抗体）：由抗 原直接免疫动物获得 2、单克隆抗体：小鼠免疫脾细胞 ＋骨髓瘤细胞＝杂交瘤细胞 当前第131页\共有186页\编于星期四\13点 （一）抗血清的制备 1、免疫原的制备：免疫物质＋佐剂 2、动物免疫：兔、羊 3、试血及效价测定 4、免疫动物血液采集和抗血清的分离 当前第132页\共有186页\编于星期四\13点 （二）单克隆抗体的制备 当前第133页\共有186页\编于星期四\13点 二、抗体的纯化 1、非专一方法（化学方法）：提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白 2、专一方法：利用免疫吸附剂和亲和层析色谱的方法得到免疫学上专一性的抗体。 当前第134页\共有186页\编于星期四\13点 （一）IgG的化学分离 1、冷酒精沉淀法 2、中性盐分段沉淀法 简便、常用 利用硫酸铵或硫酸钠沉淀免疫球 蛋白。 当前第135页\共有186页\编于星期四\13点 （二）利用免疫吸附剂纯化特异性抗体 1、利用特异性抗原纯化特异性抗体抗原与不溶性载体结合，制成特异性的免疫吸附剂。 当前第136页\共有186页\编于星期四\13点 2、利用特定的细菌蛋白纯化特异抗体 从葡萄球菌中分离出的A蛋白和从链球菌中分离出的G蛋白在一定条件下可与各种免疫球蛋白的Fc端相结合。 A蛋白与不溶性载体结合后可以纯化免疫球蛋白。 商品A蛋白载体：Sepharose 4B 当前第137页\共有186页\编于星期四\13点 基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ① 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ② 酶标记的抗原或抗体（标记物） ③ 酶作用的底物（显色剂） 酶联免疫吸附分析法（ELISA） 当前第138页\共有186页\编于星期四\13点 当前第139页\共有186页\编于星期四\13点 当前第140页\共有186页\编于星期四\13点 酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。 具有酶促反应，显示出生物放大作用。 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。 1、HRP催化过氧化物的氧化反应。 供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nm TMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm 2、AP为磷酸酯酶 一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应 当前第141页\共有186页\编于星期四\13点 磷酸钙共沉淀法 GM Food –生物技术 当前第95页\共有186页\编于星期四\13点 脂质体载体包埋法 GM Food –生物技术 当前第96页\共有186页\编于星期四\13点 载体介导法 GM Food –生物技术 烟草原生质体与Ti质粒共转移培养法 当前第97页\共有186页\编于星期四\13点 花粉管通道法 GM Food –生物技术