第三章动物细胞工程制药演示文稿.pptVIP

2. 细胞计数：细胞分离制备成悬液准备接种时需进行细胞计数。 细胞计数方法： ①自动细胞计数器计数：电子细胞自动计数器，计数速度快，但无法分辨死、活细胞。 全自动细胞计数分析仪 当前第63页\共有98页\编于星期三\8点 ②血球计数板计数：计数时细胞染色，可分辨死、活细胞。 将细胞悬液进行适当的稀释，然后吸取少量的稀释后悬液滴于计数板上盖玻片一端，让液体填满盖玻片下方间隙，不要产生气泡，稍静置几分钟在显微镜下观察并计算四角大格内的细胞数，细胞压线只计算压上线和右线的，然后利用公式： 每毫升细胞数=4大格中细胞总数/（4×10000×稀释倍数） 上面公式中分母乘以10000是因为四角每一个大格面积为1mm2，盖玻片和计数板之间的间隙为0.1mm，所以每一个大格内容积为0.1mm3，要计算1 ml悬液的细胞数就要扩大10000倍。 可以通过染色的方法区别细胞的死活。常用的染色剂有： ①台盼蓝，是一种细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。 ②苯胺黑，色较台盼蓝深，有毒。 当前第64页\共有98页\编于星期三\8点 血细胞计数板 当前第65页\共有98页\编于星期三\8点 ③结晶紫染色细胞核计数 结晶紫染色液具有低渗作用，使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色，镜下对细胞核计数。 微载体细胞培养中使用。 ④MTT染色计数 细胞内线粒体脱氢酶将MTT（四甲基偶唑盐，蓝色）转变为不可溶性的紫色结晶（甲臜）。 当前第66页\共有98页\编于星期三\8点 3 细胞传代 细胞生长至一定时期时会产生接触抑制现象，不能无限生长，若细胞不及时分种，细胞就会死亡、脱落。 悬浮细胞的传代：加入1倍或几倍的生长液，然后分种两只或多个培养瓶。 贴壁细胞的传代：需经消化液消化后再分种。 当前第67页\共有98页\编于星期三\8点 （1）要确保需消化的细胞无污染； （2）加入消化液适量，以摇动时能盖满单层细胞为宜； （3）消化时间要适量，一般室温2-5分钟，细胞层出现网孔时即可停止； （4）终止消化要先去掉消化液，再加入含血清的培养基； （5）分种数取决于细胞数和细胞特性，一般20万-30万个/ml，每次1传2或1传3为宜； （6）已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次； （7）传代细胞培养时必须标明传代次数； （8）传代后1-2天更换培养液，3-5天传代一次。 贴壁细胞分种的主意事项： 当前第68页\共有98页\编于星期三\8点 4.细胞的冻存和复苏 （1）细胞的冻存 细胞的冻存常采用液氮低温冻存，在冻存过程中需加入适量甘油或二甲基亚砜作为保护剂。 如采用冷冻方法冻存要注意冷冻速度的把握，温度下降以1℃/min为宜。 当前第69页\共有98页\编于星期三\8点 Vero细胞：从正常的成年非洲猴肾中分离的贴壁依赖性成纤维细胞，核型2n=60，高倍体率1.7%，利用199培养基添加5%太牛血清培养，可支持多种病毒的增殖并制成疫苗。 WI-38细胞：从女性高加索人的正常胚肺组织中获得成纤维样二倍体细胞，核型2n=46，利用BME培养基添加10%小牛血清培养。 当前第31页\共有98页\编于星期三\8点 鼠骨髓瘤细胞：具有很轻增殖能力的可以无限培养的细胞。分泌量大、容易转染、易生长、可以在无血清培养基中高密度悬浮培养，而且能对蛋白进行糖基化修饰，表达机制明确。 SP2/0-Ag14细胞：从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合后形成的SP2/HL-Ag再亚克隆后分离获得，常用DMEM培养基添加10%胎牛血清培养，广泛的用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。 当前第32页\共有98页\编于星期三\8点 五、细胞库的建立 用于生产的工程细胞必需建立两个细胞库：原始细胞库（MCB)和生产用细胞库（MWCB）（工作细胞库,WCB）。 MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，二倍体细胞要尽量是群体倍增水平低的细胞。 当前第33页\共有98页\编于星期三\8点 MCB细胞档案： （1）该细胞的历史——来源、动物年龄、性别、细胞分离的方法和所用的培养材料等。 （2）细胞的特性——形态、生长的特性、种源特性、重组细胞的载体构建资料、基因拷贝数、表达产物的性质和产量及稳定性等。 （3）对各种有害因子检查的结果——细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括发转录病毒。 当前第34页\共有98页\编于星期三\8点 WCB