第二章基因工程酶学基础演示文稿.pptVIP

3）ATP浓度 一般，浓度范围在10 μmol-1 mmol/L，ATP最适的终浓度为0.5 mmol/L。 ATP浓度高至5 mmol/L，影响平头末端的连接。 ATP浓度高至7.5 mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。 当前第62页\共有96页\编于星期三\9点 相同的分子末端间存在竞争，形成不同构型的DNA分子（自身环化、线形多聚体、环化多聚体以及重组质粒）。 分子越小、浓度越低越容易形成自身环化；另要注意载体与目的DNA浓度之比。 4. DNA片段末端类型与浓度 插入片段：载体= 3 : 1 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 单酶切产物连接比例需要更高。 当前第63页\共有96页\编于星期三\9点 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 6、平头双链DNA片段的连接操作 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 当前第64页\共有96页\编于星期三\9点 7、DNA连接的反应体系 DNA+vector 3:1 ligase