DB37_T 2032-2012布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术.pdf

ICS 65. 020. 30B 41DB37山 長东省地方标准DB 37/T 2032—2012布鲁氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术Competitive Enzyme-linked Immunoassay Diagnostic Criteriaon Brucella Infection2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 2032—2012前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省动物疫病预防与控制中心，本标准主要起草人：杨宏军、田夫林、何洪彬、侯明海、仲路峰。I DB37/T 2032—2012布普氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术1范围本标准规定了动物布氏菌病竞争酶联免疫吸附试验诊断技术的操作要求。本标准适用于动物布鲁氏菌感染特异抗体的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T18646-2002动物布鲁氏菌病诊断技术GB19489-2008实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1布鲁氏菌病Brucellosis布普氏菌（Bruce11a）感染引起的急性或慢性人兽共患传染病，表现为流产，主要感染山羊、牛、绪及绵羊等，可导致人发热出汗、肝脾肿大、骨关节炎、睾丸炎和心内膜炎，4试剂及仪器4.1试剂流产布普氏菌光滑型脂多糖抗原包被的微量板冻干单克隆抗体辣根过氧化物酵标记交联物20倍浓缩吐温磷酸盐缓冲液PBS-Tween样本稀释缓冲波底物溶液（含H0的四甲基联苯胺底物缓冲液，避光！）终止液（含硫酸）A阳性对照血清B阴性对照血清C弱阳性对照血清4.2仪器 DB37/T 2032—2012精密移液器（5-200μL)酵标仪，450mm滤光片检测方法（竞争酶联免疫吸附试验）5.1样品的采集和处理被检动物血液采集及血清分离参照GB/T18646-20025.2操作步骤5. 2. 1试验所有试剂回温到18-25℃C，5.2.2对照和样本的稀释在微量板内直接稀释样本和对照：在微量板孔内加入45L样本稀释缓冲液a)加入5L血清对照。分别于适当孔内加入阳性对照、弱阳性对照和阴性对照，b)在2个适当的孔内（作为交联物对照控制，Cc）加入5口L样本稀释缓冲液c)在每个待检孔内如入5μL样本。为试验控制，建议样本设重复（1次）。5. 2. 3所有对照和样本孔内加入50μL单抗溶液（加入时间差小于10min）。5. 2. 4将微量板密封后于振荡器上震荡5min以充分混合5. 2. 5室温（18-25℃）孵育30min.5. 2. 6以PBS-Tween缓冲液洗涤微量板4次，每次洗涤各孔充满、空净、即板5. 2. 7每孔加入100L交联物落液，将微量板密封后室温孵育30min.5. 2. 8重复步骤5.2.6.5. 2. 9每孔加入100μL底物溶液，并在室温条件下孵育10min。第一孔如入后开始计时。5. 2. 10每孔加入50L终止液，混合均匀，终止反应。终止液加入顺序同上一步。5. 2. 11于酶标仪450nm读取对照和样本的光密度值（0D），以空气作为空白，应在如入终止液15min内读取.6结果判定6.1计算每一对照和样本的平均OD值，6.2按照下列公式计算对照和样本的百分抑制值（PI)PI=100(平均JODr本/*100)/平均ODxx2根据下列标准值范围确定本试验数据的有效性。OD Cc0. 752. 0PI阳性对照85110PI弱阳性对照3060PI阴性对照10156.3检测样本结果试验有效条件下，根据下列范围确定所检测样本的结果。PI值结果2 DB37/T 2032—2012 30%阴性%0阳性废弃物的处理和检测过程中安全措施按照GB 19489-2008和GB/T18646-2002执行。3