DB37T 1211-2009猪繁殖与呼吸综合征快速诊断技术规范.pdf

1CS 65. 020. 30B43DB37山东省地方标准DB37/T繁殖与呼吸综合征快速诊断技术规范Rapid diagnostic methods of porcine reproductive andrespiratory syndrome2009-03-03发布2009-04-01实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T标准的附录A为规范性附录。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：王金宝、李俊、吴家强、丛晓燕、张秀关。 DB37/T紧殖与呼吸综合征快速诊断技术规范1范围本标准规定了猪察殖与呼吸综合征（FRRS）的RTHPCR诊断方法。本标准适用于未免疫者紧殖与呼吸综合征疫苗猪场的快速诊断、血液、组织脏器及材料的无害化处理。22规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的写用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T767高致病性禽流感无害化处理技术规范3材料3.1器材3.1.1微量移液器(5μL和100μL)3.1.2220000g低温离心机3.1. 33聚合酶链式反应仪3.1.4北京六一电泳仪3.1.55水平电泳槽3.1. 66凝胶成像系统3.1.71L容量瓶3.2试剂3.2 1 Trizol3.22三氯甲烷3.23异丙醇3.24DEFC（焦碳酸二乙酯）处理水：配制见A.1章。3.2575%亿醇：配制见A2章。以上试剂全部为国产分析纯3.26电泳级1%晾脂糖：配制见A.3章。3.27TAE工作液：配制见A.4章。3.2810m/的浪化乙锭（EB）水溶液。3.29DNAMarker2000：购自大连宝生物技术有限公司。3.3引物FSX1: 5° TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC3*FSX2: 5° GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT3*4方法4.1病料的处理将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1：4倍稀释，取悬液-20℃反复冻融3次，8000g离心10min，取上消液一80C保存备用。1 DB37/T1211—20094.2病毒RNA的提取4.21取研磨液（或血清）300uL加入600uLTrizol，报荡混匀室温静置5min。4.22加入200uL三氯甲烷用力顺倒3-5次，离心管混匀后静置5min，12000g离心10ming4.23取上清液，加入500μL异丙醇，报荡混匀后，室温放置10min，12000g离心10min。4.24弃去上清液，加入1mL75%乙醇吹打落解，7500g离心5mina4.25弃上清，20-25C静置15min，使RNA沉淀干燥。4.26加入10μL的DEPC处理水游解RNA，用于反转录。4.3反转录取提取的RNA7μL，0ligo（dT）1μL70C作用10nin，后于冰上加入5X反应缓冲液4μL、dNIP混合物3uL、RnaseInhibitor1uL、双蒸水3uL、MHMLV（鼠源反转录酶）1uL，42C水浴1ha用下游引物PSX2进行反转录。以此合成的cINA为模板进行PCR反应。4.4聚合酶链式反应（FCR），详见表1。表1聚合酶链式反应体系步骤110×反应缓冲液5. 0 μL步骤2dNIP混合液 (2, 5 pol/μL)4. 0 μL步骤3PSX1 (25 pllol/μ L)1. 0 μL步骤4步5PSX2 (25 pllol/μ L)1. 0 μL步豫6MsCl(25 mMb1)4, 0 μLdXNA5. 0 μL步骤7TagDNA 聚合酶(5 u/μL)0. 5 μL步孵8无菌HO29, 5 μ LPCR程序设定每次PCR均应设一个阳性对照（FRRSVSDI株）和一个阴性对照，具体参数见表2。表 2PCR反应程序设定步1温度时间95°℃Emin步骤23.16Imin步骤354.5CInin步472℃Imin步重复步骤2~428次步672°℃5 min5电泳电压100V电泳40min，取1%琼脂糖凝胶在含10mg/mlL的溴化乙锭（EB）水溶液中染色15min，在INA凝胶成像系统仪下观察并拍照。6结果的判断和解释在阳性对照和阴性对照成立的情况下，即阳性对照扩增出494bp大小的特异性条带，阴性对照无特异性条带。若扩增出大小为404bp片段为变异毒株，扩增出494bp片断为传统的FRRSV。病料及材料的无害化处理对检测的病料应当进行无害化处理，可采取深埋、楚烧等方法（按NY/T76