DB37_T 3005-2017猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山 東东省地方标准DB37/T3005—2017猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术Technology of Isolation and RT-PCR detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus2017-08-18发布2017-0918实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3005—2017前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、陈智、陈蕾、赵鹏伟、郭立辉、于江、季俊、杜以军、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。I DB37/T 3005—2017猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术的要求。本标准适用于猪肠道内容物、排泄物或乳汁样品中猪流行性腹泻病毒的分离与检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件，DEPC水：DEPC（DiethyPyrocarbonate）处理并灭菌后的去离子水DMEM:细胞培养基(Dulbeccos Modified Eagles Medium）PEDV：猪流行性腹泻病毒（Porcine EpidemicDiarrheaVirus）。双抗：青霉素、链霉素混合液（Penicillin-StreptomycinSolution）。CPE：致细胞病变效应（cell cytopathiceffect）。4仪器与试剂除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》，所用化学试剂应为分析纯。4.1病毒分离需要的仪器与试剂4. 1. 1微量可调移液器（最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL）。4. 1. 220000g高速冷冻离心机。4. 1. 3高压灭菌锅。4. 1. 437℃二氧化碳细胞箱。4. 1. 5II级生物安全柜。4. 1. 6超低温冰箱：可控温至-70℃。4. 1. 7PBS.4. 1. 8双抗（100×）（青霉素10000IU/mL，链霉素10000μg/mL），4. 1. 9DMEM 培养基。4. 1. 10Vero细胞。4. 1. 11新生胎牛血清。 DB37/T 3005—20174.1.12胰酶。4. 1. 13一次性25cm细胞培养瓶。4. 1. 14一次性10mL吸管。4.1. 15一次性0.22μm滤器。4.1.161.5 mL离心管。4.2RT-PCR检测需要的仪器与试剂4. 2. 1微量可调移液器（最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL）。4. 2. 220000g高速冷冻离心机。4. 2. 3PCR 仪.4. 2. 4高压灭菌锅。4. 2. 5普通冰箱。4. 2. 6超低温冰箱：可控温至-70℃。4. 2. 7PBS.4. 2. 81.5 mL离心管。4. 2. 9阳性对照：PEDVCV777疫苗毒株。4. 2. 10阴性对照：DEPC水。4. 2. 11引物：采用套式PCR进行扩增，设计2对引物。PEDV外F5-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3”，PEDV外R5AACCCTAAGAGGGGCATAGA3’,PEDV内F5GGGCGCCTGTATAGAGTTTA3-PEDV内R5′ AGACCACCAAGAATGTGTCC3° 6方法5. 1样品采集5.1.1活体采样采集腹泻猪的排产物0.5g~~0.7g或采集乳汁0.5mL~0.7mL。5.1.2病死猪采样采集小肠肠道内容物1g~1.2g。5.2样品处理将样品按1:4的比例加入PBS，混匀并反复冻融2~3次后，以2000r/min，4℃离心5min，取上清，12000r/min4℃离心15min，收取上清，过滤除菌置于-70℃保存备用。5.3病毒分离与鉴定取24h生长良好的Vero单层细胞，弃掉增养液，用PBS洗细胞2次，按照每25cm培养瓶中加入200μl的比例添加处理好的上清，同时加入终浓度为5μg/mL的胰酶，37C吸附1h（注意期间每隔20min轻摇一次）。之后加入终浓度为5μg/mL胰酶的维持液（不含血清），37℃培养3d，其间逐日观察。传代的细胞培养物反复冻融3次，收取病毒液用同样的方法盲传3代。每次传代均设不接病毒但含相同胰酶浓度的对照组细胞。鉴定方法详见5.4。5.4病毒RT-PCR检测技