DB23-T1336-2009转谷氨酰胺酶活性的测定.pdf

ICS 67.220X 40DB23备案号：黑龙江省地方标准DBZ/T-2009转谷氨酰胺酶活性的测定2009--Z实施2009-反.A本发布黑龙江省质量技术监督局发布 DB××/T ××××--2008前言本标准由黑龙江省农业委员会提出。本标准由黑龙江省农业标准化技术委员会归口。本标推由东北农业大学食品学院起草。本标准主要起草人：于国萍，邵美丽，张英华，安静。 DB××/T ×××x—2008转谷氨酰胺酶活性的测定1范围本标准规定了食品用转谷氨酰胺酶活性的测定方法。本标准适用于食品用转谷氨酰胺酶酶活的测定。本方法的线性范围；1μmo1/mL-7μmo1/mL。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3方法原理本试验以羟胺呈色法测定酶活，转谷氨酰胺酶(简称TGase)的活性可以通过将伯胺羟基引入到合成基质一苯甲基氧化碳酰-谷氨酰胺-甘氨酸（CBZ-G1n-G1y），生成的氧酸可与氯化铁-三氯乙酸溶液（FeCl:-TCA）形成红色络合物，用分光光度计在525nm下，测定其吸光度的大小，该物质的含量与酶活性呈正比。第一步:TGaseCBZ-G1n-G1y+羟胺(NH2OH)氧酸+ NH:第二步:氧酸+氯化铁（FeCl3）+三氯乙酸（TCA）三价铁红色络合物4试剂与仪器4.1试剂所用试剂均为分析纯；试验用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法规定的三级水的要求。a）苯甲基氧化碳酰-谷氨酰胺-甘氨酸（CBZ-Gin-Gly）);b）L-谷氨酸--单羟氧酸（L-glutamic acid －y-monohydroxamic acid）;c）盐酸羟胺（NH2OH-HC1）;d）还原型谷胱甘肽（Reduced Giutathione Tablets);e）三羟甲基氨基甲烷（Tris);f）3mol/L盐酸（HC1）溶液；g）12%三氯乙酸（TCA）溶液：h）5%氯化铁（FeCl：）溶液（溶于0.1mol/LHCl溶液）；i）Tris-HC1缓冲液（0.2mol/L，pH 6.0)：称取24.228g Tris于1000mL烧杯，加600m1H20，用磁力搅拌器使其溶解，用2mo1/LHC1调pH至6.0，将混合物移至1L容量瓶加H20定容至1L。4.2.仪器a）分光光度计：b）高速离心机; DB××/T ××××—2008c）振荡混合器；d）精密pH计；e）磁力搅拌器；f）天平：感量0.0001g。5检测方法5.1酶溶液制备称取1g转谷氨酰胺酶（精确到0.0001g）在冰浴的条件下加入到100mL，0.2mo1/L的Tris-HC1缓冲液（pH6.0），搅拌20min，用离心机在4℃下于8000转/min离心15min，除去不溶物，上清液用于酶活测定。5.2标准曲线的绘制试剂A：准确称取0.695g(0.01mo1)NH2OH-HC1，0.308g(0.001mo1）还原型谷胱甘肽，1.0119g（0.003mo1）CBZ-Gln-Gly，置于100mL烧杯，加50mLHz0，用磁力搅拌器混合均匀（约20min）。加2.423g（0.02mo1)Tris，至完全溶解。用1mo1/LHC1调节pH为6.0，将混合物移至100mL容量瓶中加Hz0定容至100mL，此即为100mL试剂A。试剂B：由3mo1/L的HC1溶液、12%三氯乙酸（TCA）、5%FeC1：（溶于0.1mo1/LHCi溶液）按1:1:1的比例混合而得。用 0.2mol/L 的 Tris-HCl缓冲液（pH6.0）配制7umol/mL的标准品L-谷氨酸-y-单羟氧酸。并将其依次稀释成1、2、3、4、5、6、7μumol/ml7个梯度。取7个试管，依次加入稀释液0.2mL、试剂A2mL，振荡混合均匀，37℃水浴10min（精确计时），每管中加入试剂B2mL，振荡混合均匀。在525nm下测定反应液吸光度。以吸光度与L-谷氨酸-Y-单羟氧酸的浓度制作标准曲线，求出曲线回归方程。5.3转谷氨酰胺酶活性的测定在试管中推确吸取2mL试剂A，再加入0.2mL酶液，于37℃反应10min后，添加2mL试剂B终止酶反应，并形成红色铁络合物，于525nm测定吸光度（A）。对照组用失活酶液。利用标准曲线回归方程，由吸光度（A）求出氧酸浓度（C）。转谷氨酰胺酶活力单位（U)为：每分钟产生1μmol氧酸所需酶量，计算酶活力。6结果计算样品中酶活力按式（1）计算：(1)txW式中:-氧酸浓度umol/mL;一反应