HS_T 13-2006牛、羊、鹿源性成分鉴定方法 实时荧光PCR方法.pdf

1CS 65. 120B 40/49HS中华人民共和国海关行业标准HS/T 13—2006牛、羊、鹿源性成分鉴定方法实时荧光PCR方法Identification of bovine, sheep, goat and deer-derived materialsReal-time fluorescence PCR method2007-03-28发布2007-04-01实施中华人民共和国海关总署发布 HS/T 13—2006前本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国海关总署关税征管司提出。本标准由中华人民共和国海关总署政策法规司归口。本标准起草单位：中华人民共和国大连海关。本标准主要起草人：尹兵、李大志、孙利， HS/T 13—2006牛、羊、鹿源性成分鉴定方法实时荧光PCR方法1范田本标准规定了牛、羊、鹿（指牛、羊和鹿种属）源性成分产品使用实时荧光PCR定性分析方法的DNA的提取、实时荧光PCR方法，本标准适用于进出口含牛、羊、鹿源性成分产品的SYBR*GreenI实时荧光PCR定性分析。2总则按照本方法规定提取样品的DNA，应用实时荧光PCR技术针对特异性牛、羊、鹿动物源性成分基因片段进行扩增，对目的基因进行扩增，反应体系中加人SYBR*Green1嵌合荧光染料，通过检测目的基因是否有荧光信号的增幅来判断样品中是否存在牛、羊、鹿动物源性成分，并通过测定扩增产物的DNA融解温度判断反当动物源性成分的种类。3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本标准：3. 1. 1牛、羊，鹿源性成分bovine，sheep，goat and deer-derivedmaterials牛、羊、鹿种属特异性DNA片段。3. 1. 2实时荧光PCR Real-Time Fluorescence PCR通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程，3.2缩略语下列缩略语适用于本标准：BSA牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）O*HPP双蒸水(double distilled water)DNTP脱氧核糖核苷兰磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）EDTA乙二胺四乙酸 (ethylene diaminetetraacetic acid)GuSCN异硫氰酸服（guanidiniumisothiocyanate)PCR聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)Taq水生栖热菌（Thermusaquaticu）TETris-CI、EDTA缓冲液Tris三（羟甲基）氨基甲烷（tri-bydroxymethyl aminomethane）Triton X-100辛基苯氧基聚乙氧乙醇4试剂和仪器试剂和材料本标准使用下列试剂和材料：a）牛、羊、鹿动物源性成分检测用引物（对）序列为：正向引物； 5-GAT GCT CCG TTT GCG TGT A-3反向引物：5-ACA GGC CTA TTC CTA GCA AT-3*57 HS/T 13—2006b)氯仿e)异丙醇d)70%乙醇e)裂解液;5 mol/L GuSCN; 0.05 mol/L Tris-HCl,pH 6.4; 0.02 mol/L EDTA,pH 8.0;1. 3 % Triton X-100.f)TE 缓冲波: 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0, 1 mmol/L EDTA, pH 8. 0。g)ddH,Oh)TaqDNA聚合酶i)dNTPs;dATP,dTTP、dCTP、dGTPj)10XPCR缓冲液100 mmol/L KCl, 160 mmol/L(NH,;SO,, 20 mmol/L MgSO,, 200 mmol/LTris-HCI (pH 8. 8), 1 % Triton X-100, 1 mg/mL BSA,k)SYBR*GreenI嵌合荧光染料除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌去离子水，安全提示：本标准使用的氢仿和异丙醇为有害和易挥发试剂，使用者应当在无明火、通风良好的环境中进行操作。4. 2仪器和设备本标准使用下列仪器和设备：a)离心机;b)pH计;c)移被器;10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL;d)实时荧光PCR仪。5测定步票5. 1模板DNA提取称取50mg经粉碎的试样于1.5mL离心管中，加人200pLTE，混匀；加人400μL裂解被，加400μL氢仿，混匀；10000rpm高心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10.000rpm离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μLTE，溶解沉淀。也可用市售DNA提取试剂盒提取DNA模板。5. 2实时费光PCR扩增和