DB37_T 3533-2019驴骡马皮张源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法.pdf

ICS65. 020. 01B 40DB37山東东省地方标准DB37/T3533—2019驴骤马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法Identification of donkey, mule/hinny and horse derived materials in leatherReal-time fluorescent PCR method2019-03-21发布2019-04-21实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 3533—2019目次前言II1范围，2规范性引用文件3术语和定义4原理.5试剂或材料5.1试剂5.2材料5.3配制溶液6仪器设备7检测用引物和探针8试验步骤8.1样本制备8.2DNA提取8.3实时荧光PCR反应9试验数据处理9.1PCR有效性判定，9.2检测结果分析和表述10检测过程中防止交叉污染的措施录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、、反应体系和结果判定。（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列 DB37/T 3533—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心、山东东阿国胶堂阿胶药业有限公司、山东宏济堂制药集团股份有限公司、济南张景牧业科技发展有限公司。本标准主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、董书光、徐慧、孟朝红、余彩娟、联加亮郝大魁、张同清、潭晴晴、步迅、陈淑娟。II DB37/T 3533—2019驴骤马皮张源性成分鉴定实时荧光定性PCR法1范围本标准规定了驴、骤和马3种动物皮张源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。本标准适用于动物皮张及初加工品中驴、骤和马3种源性成分的定性检测。本方法检出限为0.5%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1实时荧光PCRrealtime fluorescence PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3. 2Ct值cycle threshold每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阀值时所经历的循环数4原理根据核基因ckM(creatinekinaseofmuscle)为靶基因设计马属动物通用引物以及驴和马特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阔值，判定动物皮张驴、马和骤3种动物源性成分。试剂或材料除另有规定外，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂1 DB37/T 3533—20195.1.1氯化钠（NaC1）。5. 1. 2浓盐酸（HC1）。5. 1. 3三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）。5. 1. 4二水乙二胺四乙酸二钠（Na;EDTA·2H0）5. 1. 5十二烷基硫酸钠（SDS）。5. 1. 6蛋白酶冻干品。5. 1. 7异硫氰酸胍（GuSCN），5.1. 8硅珠。5. 1. 9无水乙醇。5. 25. 2. 1驴、骤和马3种动物皮张源性成分实时荧光PCR定性检测试剂盒。5. 2. 22×TaqManMasterMix：含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/20μL）、Mg（终浓度2.0mmo1/μuL）dNTPs （终浓度 0.2 mmo1/μL）5.3配制液5. 3.11mo1/LTris-HC1(pH8.0）溶液：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷置于100mL烧杯中，加入80mL水，用浓盐酸调节pH至8.0，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5. 3.21mol/LTris-HC1(pH 6.4）溶液：称取12.1g Tris置于100 mL烧杯中，加入80 mL水，用浓盐酸调节pH至6.4，转移至100mlL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121C）灭菌20min，室温保存待用。5. 3. 30.5mo1/LEDTA（pH8.0）溶液：称取18.61g二水乙二胺四乙酸二钠置于100mL烧杯中，加入 80 mL水,用10%的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸气压（121℃）灭菌20min，室温保存待用。5. 3. 410%SDS：称取10g十二烷基硫酸钠溶解于80mL无菌