DB37_T 3532-2019羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法.pdf

ICS67.100. 01X 16DB37山東东省地方标准DB 37/T 3532—2019羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法Identification of caprine, sheep and bovine derived materials in goat or sheep milkReal-time fluorescent PCR method2019-03-21发布2019-04-21实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 3532—2019目次前言111范围，2规范性引用文件3术语和定义4原理.5试剂和材料5.1试剂5.2材料6仪器设备了检测用引物和探针8试验步骤8.1取样8.2DNA提取8.3实时荧光PCR检测9试验数据处理9.1PCR有效性判定...9.2检测结果分析和表述10检测过程中防止交叉污染的措施附录A（规范性附录）实时荧光定性PCR引物/探针序列、反应体系和结果判定.附录B（资料性附录）目的基因扩增靶标参考序列 DB37/T 3532—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口本标准起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心。本标准主要起草人：胡悦、范阳阳、刘艳艳、张全芳、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕步迅。II DB37/T 3532—2019羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法1范围本标准规定了羊奶产品中羊、牛源性成分的实时荧光定性PCR检测方法本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、牛源性成分的定性检测。本方法的检出限为0.1%。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1羊源性本标准提及的羊源性成分为山羊和绵羊，3. 2实时荧光PCRrealtime fluorescence PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，对未知模板进行定性或定量分析。3. 3Ct值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。4原理根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物，在可变区设计物种特异性探针，采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增，根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阀值，判定羊和牛的源性成分。5试剂和材料 DB37/T 3532—2019除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的一级水。5. 1试剂5. 1.1氯化钠（NaC1）。5. 1. 2浓盐酸（HC1）。5. 1. 3三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）。5. 1. 4二水乙二胺四乙酸二钠（Na:EDTA·2H:0）5.1. 5十二烷基硫酸钠（SDS）。5.1. 6磷酸盐缓冲液（PBS），5. 1. 7异硫氰酸胍（GuSCN），5.1.8硅珠（silica）5. 1. 9蛋白酶冻干品。5.1. 10聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）。5.1.11无水乙醇。5.1. 12Chelex-100 树脂。5.2材料5. 2. 1生理盐水：称取0.85g氯化钠加20mL水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121℃）灭菌20min，降至室温，4℃保存备用。5. 2. 220mg/mL蛋白酶K溶液：称取0.2g蛋白酶冻干品，转移至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，分装后于-20℃C保存5. 2. 35%的Chelex-100：称取5gChe1ex-100树脂，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。5. 2. 4mo1/LTris-HC1（pH6.4）溶液：称取12.1g三羟甲基氨基甲烷置于100mL烧杯中，加入80 mL 水,用浓盐酸调节pH至6.4，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121C）灭菌20 nin,室温保存待用。5. 2. 50.5mo1/LEDTA（pH8.0）溶液：称取18.61g二水乙二胺四乙酸二钠置于100mL烧杯中，加入80mL水，用10%的氢氧化钠落液，调节pH至8.0，转移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，103.4KPa蒸汽压（121C）灭菌20min，室温保存待用。5. 2. 610%SDS：称取10g十二烧基疏酸钠落溶解于80mL无菌水中，转移至100mL容量瓶中，加水定容