DB23-T1121-2007水中军团菌检验.pdf

ICS 07. 100. 30C 53DB23备案号：黑龙江省地電方标准DB23/T*—2003水中军团菌检验实施X-*-风发布黑龙江省质量技术监督局发布 DB××/T ××××-x×××前言本标准于年　月首次发布。本标准的附录 A是规范性附录。本标准由黑龙江省卫生厅提出。本标准起草单位：黑龙江省公共卫生监测检验中心。本标雅主要起草人：万丽葵、遇晓杰、张剑峰。 DB××/T ×××x-×××x水中军团菌检验1范围本标准规定了水中军团菌（Legionella）的检验方法。本标准适用于水中军团菌的检验。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789.28--2003食品卫生微生物学检验　染色法、培养基和试剂3仪器和材料a）恒温水浴箱;b)1恒温培养箱：36℃土1℃；c）三用紫外分析仪；(p）二氧化碳培养箱：5%C0z、36℃土1℃；e)高压灭菌器;f）涡漩振荡器；g）离心机;h）显微镜、荧光显微镜；i）培养Ⅲ：直径90 m;j）过滤器：可装直径45mm滤膜；k）滤膜：孔径（0.22～0.45）μm;1）锥形瓶：500mL;m）接种针、3mm接种环；n）精密 pH 试纸。4培养基和试剂a）BCYEα琼脂平板（含L-半胱氨酸）：见附录A.1；b）BCYE-Cys琼脂平板（不含L-半胱氨酸）：见附录A.2;c）GVPC琼脂平板：见附录A.3；d）血琼脂平板：按GB/T4789.28—2003中4.6规定；e)3%过氧化氢：按GB/T4789.28—2003中3.20规定；f）明胶：见附录A.4;g）硝酸盐肉汤：按GB/T4789.28—2003中3.17规定；h）尿素酶：见附录A.5;i）氧化酶：按GB/T4789.28-—2003中3.18规定：j）１%马尿酸;k）3.5%三酮;1）革兰氏染液：按GB/T4789.28—2003中2.2规定；m）灭菌蒸馏水; DBxx/T ×xxx--xxx5 检验程序水中军团菌检验程序见图1。水样(500mL)水样处理：摇勾后静置15min，取 5mL置灭菌试管中。剩余清洁水样直接用0.22jm×47mm滤膜过滤，混浊水样先1000r／min离心1min后去除杂质，再用0.22Hm×47mml滤膜过滤，取下滤膜并尽可能剪碎，与5mL原水样混合，震荡1min。酸处理：取1mL于小试管中，加等量的0.01mo1/LHCl混合15min，用0.1mol/KOH调pH为6.8~～7.0。初分离：吸取0.1mL接种于GVPC半板36℃±1℃5%C0,培养7d~10d菌落验证：挑取第二天以后生长的可疑菌落分别转种血平板、BCYE-Cys 平板和BCYEa平板36℃±1℃5%CO,培养3d~7d在迦平板、BCYE-Cys 平板和 BCYEa 平板在血平板和 BCYE-Cys 平板上不生长，但第二天生长的菌落在 BCYE α 平板上第二天开始生长的革兰氏阴性杆菌不是军团菌可判断是军团菌菌种及型别的确定：生化及血清学实验报告图 16操作步骤6.1 采样用高压灭菌玻璃瓶无菌取水样500mL。6.2送样将样品避光避热，在6℃～18℃保存温度范围内送到实验室，至多不能超过两天。6.3水样处理6.3.1将水样摇匀后静置15min，取出5mL置灭菌试管中。剩余清洁水样直接用0.22m×47mm微孔滤2 DB××/T ××××-×××x膜过滤，混浊水样先1000r/min离心1min后去除杂质，再用0.22m×47mm微孔滤膜过滤，然后取下滤膜并尽可能剪碎，并加入5mL原水样试管中充分混合，在涡凝漩振荡器上震荡1mina6.3.2取ImL于小试管中，加入等量的0.01mol/LHC1混合15min进行酸处理，用0.1mo1/LKOH调pH 为 6. 8~~7. 0.6.4分离培养6.4.1无菌取酸处理的样液0.1mL接种到GVPC培养基平板上，用无菌L棒将接种物均勾地涂布于培养基表面（酸处理后应立即进行接种）。6.4.2待接种物水分被培养基吸收后，倒置培养基平板，于5%C0z培养箱中36℃±1℃培养7d~～10d培养箱内的凝度为80%。6.4.3从第三天起每天观察长出的菌落形态，做好标记并记下可疑菌落的数目。GVPC培养基平板上典型菌落一般为灰白色、蓝色或紫色，圆形稍凸、湿润光滑、呈毛玻璃状，挑起似牙膏状粘稠，新鲜生长出的菌落边缘有紫色光泽。6.5菌落确认BCYEα平板，倒置平板，于5%COz培养箱中36C±1℃培养3d～7d，箱内的湿度为80%。6.5.2观察菌落生长情况，凡在血平板