SN_T 3384-2012出口食品中空肠弯曲菌药物敏感性的测定 微量稀释法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3384--2012出口食品中空肠弯曲菌药物敏感性的测定微量稀释法Antibiotics sensitivity test of campylobacter jejuni in food for export-Method of microdilution2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局D SN/T 3384—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及的专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、江苏省动物卫生监督所、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、扬州大学。本标准主要起草人：薛峰、蒋原、张睿、王小军、袁芳、陈颖、袁飞、黄晓蓉、汤小勤、栾军、曾德新。1 SN/T 3384--2012出口食品中空肠弯曲菌药物敏感性的测定微量稀释法1范围本标准规定了出口食品中空肠弯油菌药物敏感性的测定方法。本标准适用于出口食品中空肠弯曲菌药物敏感性的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。4试剂和材料4.1抗生素硫酸阿米卡星（Amikacin Sulfate）、头孢噻钠（Cefotaxime sodium salt）、卡那霉素（Kanamycin）、甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim）、头孢哌酮（Cefoperazone）、磺胺对甲氧嘧啶钠（Sulfamethoxazole）、盐酸四环素（Tetracycline Hydrochloride）、氯霉素（Chloramphenicol）。4.2培养基Bolton肉汤，见 A.l;Skirrow琼脂，见 A.2。4.3参考菌株空肠弯曲菌Campylobacter jejuni，ATCC33560；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，ATCC25923。5设备5.1 移液器:0.5 μL～10 μL。5.2微需氧培养装置：提供微需氧条件（5%O2、10%CO²和85%N2）。5.396孔板。5.4酶标仪。1 SN/T 3384--20125.5麦氏比浊仪。6检测程序空肠弯曲菌耐药性有限稀释检测程序见图1。待测样品i细菌培养童用肉汤稀释到0.5MCF加入抗生素在96孔板上稀度稀释2℃±0.5℃培养24 h或者3Z℃±0.5.℃培养48h用酶标仪600 nm波长进行读数参考判读标准确定菌株药物敏感程度报告图1空肠弯曲菌耐药性有限稀释检测程序7操作步骤7.1菌液的制备将纯化好的待测定空肠弯曲菌菌落接种于Bolton肉汤，于微需氧条件下，42℃土0.5℃增菌24h后，取出摇匀，用Bolton 肉汤稀释到0.5MCF浓度后备用。7.2抗生素的稀释称取0.128g抗生素用100ml无菌超纯水溶解备用。7.3有限稀释法鉴定使用96孔板进行稀释，在第一孔中加入180 uL稀释好的菌液，在第二孔到第十二孔中加人100μL菌液。在第一孔中加人 20μl稀释好的抗生素，用移液器混匀后吸出100 μL加人到第二孔中继续混匀后加人第三孔。以此类推加到第十一孔，第十二孔用做对照。加样完成后将96孔板放人微需氧条件下，42℃士0.5℃培养24h。2 SN/T 3384—2012结果判定8将培养后的96孔板取出，用酶标仪进行读数。对生成的结果进行判读，两孔间有明显差异的认为是这种抗生素的MIC值，具体判定标准参见表1。表 1 药物敏感性判定标准MIC 判定标准μg/mL抗生素耐药教感中齐阿米卡星≥641632Amikacin头孢噻16~32≥648Cefotaxime卡那霉素16≥6432Kanamycin甲氧芊氨嘧啶≥16Λ8Trimethoprim头孢哌酮≥64≤1632Cefoperazone甲氧苄啶-磺胺甲恶唑≤2/38≥4/76Trimethoprim-sulfamethoxazole四环素N4≥16Tetracycline氯霖素≥32Chloramphenico!注：质控菌株的为空肠弯曲菌^TCC33560,37/℃48h或者42℃/24h微需氧环境。稀释基准为麦氏0.5MCF，用Bolton 肉汤稀释。 SN/T 3384--2012附录A（规范性附录）培养基与试剂A. 1 Bolton 肉汤(Bolton