SN_T 1580-2013椰子死亡类病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1580-2013代替 SN/T1580—2005椰子死亡类病毒检疫鉴定方法Detection and identification of coconut cadang-cadang viroid2013-08-30 发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局梦直行甜涂层 SN/T 1580--2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1580--2005《椰子死亡类病毒检测方法》。本标准与SN/T1580--2005相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：标准名称改为“椰子死亡类病毒检疫鉴定方法”；1一完善原标准中检测方法；修改原标准中原理；修改结果判定。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李伟东、刘福秀、韩玉春、张勇、李继勇。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1580---2005。1 SN/T 1580-2013椰子死亡类病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中椰子死亡类病毒的检疫检疫鉴定方法。本标准适用于棕榈科植物（包括种果、苗木等繁殖材料)椰子死亡类病毒的检疫鉴定。2椰子死亡类病毒的基本信息学名:Coconut cadang-cadang.viroid.分类地位：类病毒Viroid，马铃薯纺锤形块茎类病毒科 Pospiviroidae，椰子死亡类病毒属Cocadviroid。传播途径：椰子死亡类病毒主要通过种苗进行远距离传播。椰子死亡类病毒的其他信息参见附录A。3方法原理椰子死亡类病毒的基因组为环状和线状，核酸为单链核糖核酸（SSRNA），以单体和二聚体共价联结的环状或线状分子存在。其共价闭答的环形的状结构，在变性处理后转变为环状分子，而不成为线状，这种环状RNA分子在5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶中迁移率比相同分子量的线状分子要慢得多。CCCVd的RNA全序列已测定该类病毒引发的植株症状、基因组特征等为制定本标准的依据。4仪器设备、用具和试剂4.1仪器设备PCR扩增仪、多功能电泳仪、冷冻高速离心机凝胶成像分析系统、振荡器、冰箱、水浴锅、电子分析天平(感量为0.1mg)、双向电泳系统等。4.2用具微量可调移液器(0.01 μL～2 μL,1 μL～10 μl,10 μL～100 μl,10 μL～l 000 μL)、可调移液器头、刀片和研钵等。4.3试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试剂（见附录B)、RT-PCR检测试剂（见附录 C)。5病原的检测5. 1 症状检查检查棕榈科植物繁殖材料的种果、苗木等是否有可疑症状。对于来自椰子死亡类病毒发生区域的 SN/T 1580—2013植物材料，采集有可疑症状的植株叶片200g；如果没有发现任何可疑症状.随机取植株叶片200g。症状描述参见附录 A中 A.3。5.2双向聚丙烯酰胺凝胶电泳检测对采集的植物样品进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，方法见附录B。RT-PCR凝胶电泳检测5.331对采集的植物样品进行RT-PCR检测，方法见附录C。6结果判定样品经RT-PCR检测为阳性，再经双向聚丙烯酰胺凝胶电泳测定观察到RNA环状分子条带，即可判定样品中存在 CCCVd。7样品保存7.1样品保存检测表现阳性的植物样品经液氮干燥后，于一80℃下保存。保存样品做好登记和标识工作。7.2结果记录与资料保存完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果·并有实验人员的签字。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色结果照片，RT-PCR检测电泳阳性结果照片。2 SN/T 1580—2013附录A（资料性附录）椰子死亡类病毒的背景资料A.1寄主范围自然寄主为椰子（Cocos nucifera）、长柄贝叶棕（Corypha elata）、油棕（Elaeis guineensis），人工接种寄主有槟榔（Areca catechu）、散尾葵（Chrysalidocaprus lutescens）、枣椰（Phoenir dactylifera）、大王椰(Roystonea regia）、圣诞(Veitchia merrillii)等。A.2地理分布菲律宾、所罗门群岛。A.3 寄主症状早期症状持续2年～4年。叶片上产生小的，形状异常的亮黄或桔黄色斑点，折射光下呈水渍状，透射光下呈半黄色透明。果实缩小变圆，而不呈正常的三角形；果皮上出现特有的中纬划痕。在叶片出现症状1年左右，椰果比正常小些，但数量增多。随病情加重果实则变小，且伸长或变形，挂果量减少，甚室不挂果，许多果破裂。中期症状(持续2年）：叶斑数量增加并随叶龄增长而扩大，愈合成大的条纹状斑块，于是老叶出现黄化和斑驳。树冠下部2/3呈现黄化。拂