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（优选）分子诊断技术课件 当前第1页\共有21页\编于星期三\0点 常见的核酸分子诊断技术 核酸分子杂交 ( Nucleic acid molecular Hybridization) 基因芯片（ Gene Chip ） 聚合酶链反应( polymerase chain reaction reaction；PCR) 当前第2页\共有21页\编于星期三\0点 核酸分子杂交的原理 双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链成两条互补的单链核酸。 在适当温度、盐浓度下，双链能按硷基互补配对原则(A-T,C-G)复性而重新成为双链核酸。 用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸探针，与变性后的待测标本核酸进行杂交，通过检测标记探针的信号，可判断标本是否存在与探针互补杂交的同源核酸。 当前第3页\共有21页\编于星期三\0点 核酸分子杂交探针的制备 制备探针的靶核酸可通过: 分离、切割病毒的特定核酸片段获得; 用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，经扩增和纯化大量获得; 选择已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸，其长度以20个左右最为常用，过短易出现非特异性杂交。 当前第4页\共有21页\编于星期三\0点 核酸分子杂交探针的制备 常见的用于标记探针的示踪物质 放射性核素如：32P，35S，3H，125I等，杂交后可通过放射自显影技术进行检测 非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等，杂交后可通过底物显色、化学发光等技术进行检测 当前第5页\共有21页\编于星期三\0点 核酸分子杂交示意图 核酸分子杂交的程序 当前第6页\共有21页\编于星期三\0点 常用的核酸分子杂交技术 斑点杂交（spot blot hybridization） 凝胶电泳印迹转移杂交（Southern blot hybridization) 原位杂交（in-situ hybridization） 当前第7页\共有21页\编于星期三\0点 斑点杂交 Dot Bolt Hybridization for HBV DNA Quantitationin 5 μl of Patient Sera 当前第8页\共有21页\编于星期三\0点  凝胶电泳印迹转移杂交 原位杂交(Southernblot hybridization) (in-situhybridization ） 当前第9页\共有21页\编于星期三\0点 核酸分子杂交技术的应用 核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性 等 在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中 。 当前第10页\共有21页\编于星期三\0点 基因芯片 基因芯片（或DNA Chip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500μm）排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。 上图显示大量的DNA探针，按照一定的规律有序地排列在支撑物上，每个探针与相对应的特异互补序列结合后，即可发出荧光。利用该芯片可同时获取大量信息。 DNA Microarray 当前第11页\共有21页\编于星期三\0点 基因芯片技术原理 大规模集成的固相杂交 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息 当前第12页\共有21页\编于星期三\0点 基因芯片的作用原理 当前第13页\共有21页\编于星期三\0点 基因芯片的制作方式 原位合成 直接点样 原位光蚀刻合成 原位喷印合成 分子印章法 针式点样 喷墨点样 光导原位合成法 当前第14页\共有21页\编于星期三\0点 基因芯片技术流程 当前第15页\共有21页\编于星期三\0点