DB34T 3121-2018Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程.docxVIP

ICS 11.220 B 41 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 3121—2018 Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测 技术规程 Technical Regulations of PCR Assay for Detection of Fowl Aviadenovirus Serotype 4 Nucleic Acid 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 2018 - 05 - 16 实施 安徽省质量技术监督局 发 布 I DB34/T 3121—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 阜阳市立华畜禽有限公司、阜阳市动物疫病预防与控制中心、阜阳市畜牧兽医局、 颍东区畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所。 本标准主要起草人： 孟宪臣、张海涛、郭强、李东风、桑晓媛、高树朋、高永士、潘五岳、郑玉才、 罗燕、刘新、薛亚梅、吴含萍、张娟娟。 1 DB34/T 3121—2018 Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术。 本标准适用于对活禽肛拭子和病死禽肝脏进行Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 3 缩略语 以下缩略语适用于本文件。 FadV(Fowl Aviadenovirus)：Ⅰ群禽腺病毒。 FAdV-4(Fowl Adenovirus-4)：Ⅰ群血清 4 型禽腺病毒。 PCR(Polymerase Chain Reaction) ：聚合酶链式反应。 DNA(Deoxyribonucleic Acid)：脱氧核糖核酸。 ExTaq酶：从水生栖热菌 Thermus Aquaticus(Taq)中分离出的具有热稳定性的 DNA 聚合酶， ExTaq 酶是其中的一种。 PBS(Phosphate Buffer Solution) ：磷酸盐缓冲液。 SPF(Specific Pathogen Free)：无特定病原。 4 主要仪器 4.1 高速台式冷冻离心机 4.2 生物安全 II 级通风柜 4.3 PCR 扩增仪 4.4 核酸电泳仪 4.5 微量移液器(2 μL、10 μL、100 μL、1000 μL) 4.6 超低温冰箱 4.7 核酸凝胶成像系统 4.8 高压蒸汽灭菌锅 4.9 电热恒温鼓风干燥箱 4.10 微量振荡器 2 DB34/T 3121—2018 5 主要试剂 5.1 消化液(见第 A.1 章) 5.2 2％蛋白酶 K 溶液(见第 A.2 章) 5.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液(见第 A.3 章) 5.4 75％乙醇(见第 A.4 章) 5.5 Gold View 核酸染料 5.6 上游引物 P1：FAdV-4(10 μM) 5.7 下游引物 P2：FAdV-4(10 μM) 5.8 琼脂糖(分析纯) 5.9 50×TAE 缓冲液(见第 A.5 章) 5.10 PBS(见第 A.6 章) 5.11 DL2000 DNA Marker(见第 A.7 章) 5.12 10×Loading Buffer(见第 A.7 章) 5.13 双蒸水(符合 GB/T 6682 要求) 5.14 PCR 用 ExTaq(见第 A.8 章) 5.15 10×ExTaq buffer(Mg2+ plus)(见第 A.8 章) 5.16 dNTP Mixture(见第 A.8 章) 6 引物 根据 GenBank 登录的 FAdV-4 (GenBank:GU188428.1)Hexon 基因核苷酸序列， 设计用于扩增 FAdV-4 的 PCR 引物，FAdV-4 上游引物 P1：FAdV-4(5 -GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC-3) ，FAdV-4 下游引物 P2：FAdV-4(5-TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3)， 扩增核酸片段大小为 951 bp。 如果制备的核酸模板中有 FAdV-4， PCR 产物电泳后在 951 bp 处出现条带，即为阳性，反之即为 阴性。 7 样品的采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 棉拭子和 1.5 mL 离心管，经 121℃高压灭菌 15 min，烘干。