DB34T 3284-2018猪丹毒丝菌实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS 11.220 B 41 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 3284—2018 猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time PCR for the detection of Erysipelothrix rhusiopathiae 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 I DB34/T 3284—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、巢湖市畜牧兽 医局、阜阳市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所，同济大学。 本标准主要起草人： 李郁、李雪松、李春芬、张利亚、陈章、黄晓慧、孙裴、姚焱彬、张劲松、高 亚飞、孟天恺。 1 DB34/T 3284—2018 猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪丹毒丝菌实时荧光 PCR 检测方法的缩略语、试剂和仪器、样品的采集、运输与保 存、操作方法。 本标准适用于猪组织样品、血样及其细菌培养物中猪丹毒丝菌的实时荧光 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光 PCR： 荧光聚合酶链式反应 Ct 值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA：脱氧核糖核酸 Taq 酶：Taq DNA 聚合酶 PBS：磷酸盐缓冲液 Eppendorf 管：微量离心管 4 试剂和仪器 4.1 试剂 4.1.1 无水乙醇: -20℃预冷。 4.1.2 75％乙醇: 用新开启的无水乙醇和无 DNA 酶的灭菌双蒸水配制， -20℃预冷。 4.1.3 灭菌双蒸水。 4.1.4 动物组织基因组 DNA 提取试剂盒。 4.1.5 引物： ——上游引物：5′-GTGGCGCATATAATCCCGTA- 3′ ——下游引物：5′- GCAAACGCAATGGCTTCT- 3′ 4.1.6 2×TransTaq-T PCR SuperMix。 4.1.7 Taq 酶。 4.1.8 实验用水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 仪器 2 DB34/T 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5 μL。 4.2.6 4.2.7 4.2.8 4.2.9 4.2.10 3284—2018 显微镜：物镜 10 倍~100 倍。 电子天平：感量 0.1 g。 恒温培养箱：36℃±1℃ 冰箱：(2℃~8℃， -20℃， -80℃) 。 微量移液器：0.1 μL~2.5 μL、0.5 μL~10 μL、5 μL~50 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 荧光 PCR 仪。 恒温水浴锅(室温至 100℃)。 高速台式冷冻离心机：最大转速 14 000 r/min 以上。 全自动快速样品研磨仪。 混匀器 5 样品的采集、运输与保存 5.1 采样要求 采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 5.2 采样工具 5.2.1 剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf 管。 5.2.2 所有上述采样工具必须经(121 士 2)℃，15 min 高压灭菌并烘干。 5.3 样品的采集 5.3.1 组织器官 根据临床症状的不同采集典型病料。用剪刀、镊子无菌采集肾、脾、肝、心血、淋巴结、疹块及其 周围皮肤、肿胀的关节液、心脏瓣膜增生物等。 5.3.2 血清或全血 用无菌注射器直接吸取至无菌 Eppendorf 管，分离血清。或用加有抗凝剂的注射器直接吸取至无 菌 Eppendorf 管，充分混合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或 0.5 mol/L EDTA。每 6 mL 血液加 1 mL 抗凝剂。 5.3.3 细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液。对于在固体培养基上生长的菌落， 用接种棒挑取适量菌样，放入 0.01 mol/L pH 7.6 PBS 中，振荡混匀形成悬浮菌液。 5.4 样品的运输与保存 采集的样品应置于低温、密封的容器内运输。待检样品在 2℃~8℃条件下保存不应超过 24 h；若 不能在规定时间内送检的， 可保存于饱和氯化钠溶液或 30％甘油缓冲