DB34T 3283-2018副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法.docxVIP

ICS 11.220 B 41 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 3283—2018 副猪嗜血杆菌的分子分型 MLST 方法 Multilocus sequence typing detection method for Haemophilus parasuis 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 2019 - 01 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 I DB34/T 3283—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位： 安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫 生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所、同济大学。 本标准主要起草人： 李郁、陈章、李雪松、张利亚、黄晓慧、刘晓露、孙裴、汪清峰、张劲松、高 亚飞、孟天恺。 1 DB34/T 3283—2018 副猪嗜血杆菌的分子分型 MLST 方法 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌的分子分型 MLST 的术语和定义、试剂和材料、 仪器和设备、操作步骤、 生物安全及防污染措施。 本标准适用于副猪嗜血杆菌的分子分型检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 NY/T 2417 副猪嗜血杆菌 PCR 检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 管家基因 house-keeping genes 所有细胞中均要表达的一类基因， 其产物是维持细胞生命活动所必需的， 其基因序列高度保守并且 在大多数情况下持续表达。 4 试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有 试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 4.1 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 4.2 普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒。 4.3 Taq DNA 酶。 4.4 dNTP： dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 4.5 引物：扩增引物和测序引物序列见附录 A 表 A.2。 4.6 10×PCR 缓冲液：200 mmoI/L Tris-HCl (pH 8.4)，200 mmol/L 氯化钾， 15 mmol/L 氯化镁。 4.7 琼脂糖凝胶。 4.8 Gelred 核酸染色剂。 4.9 6 × 溴酚蓝上样缓冲液。 2 DB34/T 3283—2018 4.10 分子量标记：1000 bp DNA marker。 4.11 5×TBE 电泳缓冲液：445 mmoI/L Tris，445 mmol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)。使用时 稀释为 0.5 × TBE 电泳缓冲液。 4.12 质控菌株：副猪嗜血杆菌。 5 仪器和设备 5.1 离心机：最大转速 14 000 r/min 以上。 5.2 天平：量程 2 kg，感量 0.1 g。 5.3 pH 计。 5.4 涡旋振荡器。 5.5 PCR 仪。 5.6 电泳仪。 5.7 凝胶成像仪。 5.8 超净工作台 5.9 微量移液器：0.1 μL~2.5 μL、0.5 μL~10 μL、5 μL~50 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL。 6 操作步骤 6.1 细菌基因组 DNA 提取 采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒，提取经过 NY/T 2417 的方法鉴定为副猪嗜血杆菌的 DNA。 6.2 MIST 基因选择 按附录A 表A.1 所示，对副猪嗜血杆菌的 7 个管家基因进行 MLST 分析。 6.3 PCR 扩增引物和测序引物的选择 按附录A 表A.2 中的序列，合成副猪嗜血杆菌 7 个管家基因对应的 7 对 PCR 扩增引物和测序引 物。引物在使用前按照引物合成时的既定浓度进行稀释到 10 μmol/L， -20℃保存备用。 6.4 管家基因片段的 PCR 扩增 反应体系体积为 50 μL:10×PCR 缓冲液 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL、上下游引物各( 10 μmol/L ) 1 μL、Taq DNA 聚合酶( 5 U/μL)0.5 μL、模板 DNA 5μL、去离子水补齐至 50 μL。 反应条件为：预变性 95